国外植物药的研究与开发,第四章 国外植物药生产中现代科技成果的应用,中药学院 天然药物化学教研室,陈丽霞,1、植物原料的种植、采摘 2、现代化的制药技术设备 3、生产过程中的标准化控制,1、植物原料的种植、采摘,欧洲药典、英国药典、美国药典国家处方集和日本药局方均重视对植物药中的农药残留和重金属限量检查，美国药典国家处方集还对植物药的微生物检查具有明确规定。 近年来，中国出口的中药材、中成药因镉、铅、砷、汞等重金属和农药残留量超标而受阻，使中医药的声誉受到一定影响。 如何完善中药质量标准，促使中药质量标准与国际接轨，走向国际化，是当前中药国际化面临的迫切问题。中药质量标准的国际化将有助于中药的国际化。,1.1 国外对植物药原料的标准,不同国家和地区使用植物药的程度不同，对其质量控制的理念也不一致，所制定标准的条目和规定的检测限量也各不相同。 不同国家和地区对食品补充剂或植物药中的重金属和农药残留的限量标准有较大区别。,如：在重金属限量标准方面，香港、中国内地、韩国、英国以及世界卫生组织均对铬（Cr）没有设定限量要求，而美国则对铬（Cr）设立限量标准。,1.2 植物原料的种植采摘,天然药物涉及到药材资源问题：人工栽培有利于药材标准化。 对药材进行标准化的种植管理，可以提高药材的产率。 选择污染较小的栽培基地,减少污染。 选择地道药材进行栽培,保证药材的质量。 科学确定植物的生长时间，植物生长时间不同，有效成分的含量也不同。,1.2.1 银杏的标准化栽培,银杏最早出现于3.45亿年前的石炭纪。中生代侏罗纪银杏曾广泛分布于北半球，白垩纪晚期开始衰退。 50万年前，发生了第四纪冰川运动，银杏在欧洲、北美和亚洲绝大部分地区灭绝，只有中国自然条件优越，才奇迹般的保存下来。所以，被科学家称为“活化石”，“植物界的熊猫”。 银杏大都属于人工栽培, 在中国、日本、朝鲜、韩国、加拿大、新西兰、澳大利亚、美国、法国、俄罗斯等国家和地区均有大量分布。毫无疑问，国外的银杏都是直接或间接从中国传入的。,银杏种植标准化：,银杏的种植方法、苗木的管理、常见病虫害防治都有标准化的管理，以保证原材料的质量。 例如，银杏树主干树桩4-5年锯伐一次，锯伐后从根部分生出幼树，生长、采摘4-5年，又再次钜伐（研究证明，4-5年生树叶有效成分含量最高）。,1.2.2 银杏的质量控制 由于银杏的产地、种植技术和采收期不同对银杏叶所含成分（内酯和黄酮）也会有较大影响。德国的制药企业在投产前首先要对银杏叶的成分进行分析，以保证原料的内在质量的稳定。 银杏叶有效成分基本上都采用HPLC 测定, 采用山奈素、槲皮素和异鼠李素作为对照品测定银杏总黄酮的含量; 采用银杏内酯A、B、C和白果内酯A 为对照品测定银杏内酯的含量。具体测定方法分述如下：,1.2.2 银杏的质量控制 1.2.2.1 银杏中黄酮苷含量的测定方法 银杏叶中总黄酮测定方法是: 银杏叶黄酮主要成分是黄酮苷形式存在, 经酸水解后生成黄酮醇类化合物, 主要是槲皮素、异鼠李素和山奈素三种组分。用HPLC 分离测定其含量, 再经公式转换成总黄酮的含量。,1.2.2.2 银杏中萜内酯含量的测定方法 内酯主要以银杏内酯A、B、C 和白果内酯为主。国外采用一种快速、简便、准确的测定萜内酯含量的方法，先通过简便的柱色谱有效地纯化样品, 直接供HPLC 分析，分析图谱清晰，且干扰峰与待测峰能完全分离。测定结果重现性好, 准确度高。,1.2.3 银杏叶的采摘,应对大规模的采摘量，主要是采用机械采收。 刚采收的叶子，含水量高，一般达70%左右，如果不及时干燥，容易发霉变黄，采用大批量快速干燥技术进行干燥。 在种植、采收、干燥加工过程中都实现规范化，保证原料叶的质量。 科学的确定采摘期也是保证银杏叶质量的重要因素之一。,5-11月各月份生长期的银杏叶的黄酮苷元：山奈酚、槲皮素、异鼠李素含量。,5-11月各月份生长期的银杏叶的苷元和黄酮苷含量。,左： 5-11月各月份生长期的银杏叶的山奈酚衍生物、槲皮素衍生物含量。,右： 5-11月各月份生长期的银杏叶的山奈酚苷、异鼠李素苷、槲皮素苷含量,5-11月各月份生长期的银杏叶的双黄酮含量,Sc-金钱松双黄酮 Isog-异银杏双黄酮 Gink-银杏双黄酮 Bil去甲银杏双黄酮 Am穗花杉双黄酮,A：银杏内酯A，GA B：银杏内酯B，GB C: 银杏内酯C，GC D: 白果内酯A，BB,综合因素定采摘期： 1、黄酮含量 2、内酯含量 3、叶片大小 （5月份是叶芽，叶的体积最小，黄酮含量高，但收得率低，而且内酯含量也低，内酯是7月份最高。） 4、对植株生长的影响 （7月份采摘对植株的生长会产生不良影响）,最终确定采摘期：,一般在七月底八月初，先采摘苗木或幼龄树的下部叶子，采叶量不可过多，一般不超过苗木的1/3或1/4。八月底九月初采中部叶子，变黄前采上部叶，采叶时，应选择晴天进行。,1.2.4 日本重视药材的规范化种植,日本汉方药的基础研究比较细致，药材从选种、育苗开始有全程质量跟踪。 日本正在大建中药材种植基地，从国外引种药材，现已建成了约3万平方米的药材科学专业种植园。 日本学者采用生物学和遗传学的手段进行了选拔优良品种、育种及栽培移植方面的研究工作。,将现代农业栽培技术应用到药用植物栽培上，注意使用小型机械精耕细作，尽量不用化肥 和农药，以保证生药质量。 日本制订了药用植物采集管理规范（GACP）为获取优质的药用植物原料，和药物草本植物制品的生产提供了一般性的技术指南。 培育了黄连、乌药、日本当归等约500多个品种，其中栽培基地年产量可达200吨。,韩国从公元1567就开始人参的人工栽培。 多年来，韩国一直把高丽参作为拳头产品，实行原料栽种加工定点生产，种植人参在指定的区域内并规定生长年限和采挖年限，有专门技术指导，统一收购后，由政府规定在唯一的红参加工厂进行加工再出售。 高丽参与普通作物不同，对土壤的要求非常严格，一般情况下收获过一次人参的土地往往10年内无法再次种植人参。 优质的高丽参，其一株，从栽种到消费者购买之前需要长达6年以上的时间和努力。,1.2.5 韩国高丽参的规范化种植,第一步：种植地的选择。通过土壤分析、现场勘查、耕种人访谈等过程选择耕地。评价相关土地的土质及土地的方向、坡度、位置等，采集土壤样本进行农药及重金属污染度、土地肥沃度等19个项目的检查。 第二步：栽培地的管理。相关部门通过定期进行现场耕作情况调查，施行严格彻底的栽培状态管理。允许使用的农药种类只有3种，这些农药也都是具有撒药3天后自然降解能力的水溶性产品。第三步：收购。6年根高丽参在经两次农药检查合格并获得适合收购判定后，就会被确定收割日期。,2、现代化的制药技术设备,植物药（中药）提取物对生产条件、生产技术要求很高，在西方，很多先进的提取、分离、纯化和干燥设备和技术应用于植物药提取物的生产。 很多设备和技术是随着植物药的研发而应运而生，围绕着植物药的生产需求而被打造出来的。,2.1 植物药生产技术： 经典的水-有机溶剂提取法是目前国内外使用的最广泛的技术。很多先进的提取、分离、纯化、干燥设备和技术应用于植物药提取物的生产中。,（一）常温超高压技术,高压生物化学研究已经证明：压力达到一定值，蛋白质、多糖（淀粉、纤维素）等有机大分子会发生变性，但生物碱、低聚糖、甾、萜、苷、挥发油、维生素等小分子物质则不发生任何变化。 超高压提取就是利用了超高压对生物材料的这种作用实现有效成分提取的。植物细胞壁上有很多微孔，因此我们可以把植物细胞壁看作是由许多微孔组成的薄膜。当植物细胞处于溶剂中时，溶剂将通过这些微孔进入细胞内部。 常温超高压提取技术可以使用多种溶剂，包括水、不同浓度的醇和其它有机溶剂，可以从不同的天然产物中提取不同性质（如生物碱、黄酮、皂甙、多糖、挥发油）的有效成分。,（二）超声波提取技术,超声波是一种高频率的机械波。超声场主要通过超声空化向体系提供能量。频率范围在15-60kHz的超声，常被用于过程强化和引发化学反应，超声波在天然产物有效成分提取等方面已有了一定作用。其原理主要是利用超声的空化作用对细胞膜的破坏，有助于有效成分的溶出与释放，超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应使水温基本在57，对原料有水浴作用。超声波提取与传统的回流提取、索氏提取法比较，具有提取速度快、时间短、收率高、无需加热等优点。已被许多天然产物分析过程选为供试样处理的手段。,（三）微波辅助提取技术,微波是一种非电离的电磁辐射。微波辅助提取（Microwave Assisted Extraction，MAE）是利用微波能来提高萃取率的新发展起来的技术。微波辐射诱导萃取技术具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分收率高的特点，已被成功应用在药材的浸出、中药活性成分的提取方面。它的原理是利用磁控管所产生的每秒24.5亿次超高频率的快速震动，使药材内分子间相互碰撞、挤压，这样有利于有效成分的浸出，提取过程中，药材不凝聚，不糊化，克服了热水提取易凝聚、易糊化的缺点。 微波萃取技术有一定的局限性，只适宜于对热稳定的产物。,（四）超临界流体萃取技术,超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）技术是20世纪60年代兴起的一种新型分离技术。20世纪80年代，由于其选择分离效果好、提取率高、产物没有有机溶剂残留、有利于热敏性物质和易氧化物质的萃取等特点SFE技术逐渐被运用到天然产物有效成分的提取分离上，并且与GC、IR、GC-MS、HPLC等联用形成有效的分离技术。 超临界流体（SF）是指在临界温度和临界压力以上，以流体形式存在的物质，目前研究较多、最常用的超临界流体是二氧化碳。在超临界状态下将SF与待分离的物质接触，使其有选择性地溶解其中的某些组分。SF的密度和介电常数随着密闭体系压力的增加而增加，因此利用程序升压可将不同极性的成分进行分步提取。,（五）大孔树脂吸附,大孔吸附树脂是一类新型高分子分离材料，是一种高聚物吸附剂，根据其孔径、比表面积及构成类型分为许多型号。20世纪70年代开始用来进行天然产物有效成分的分离纯化研究。 大孔吸附树脂分离技术的应用原理主要是利用大孔吸附树脂的吸附性和分子筛相结合的原理，从天然产物提取液中有选择的吸附其中的有效成分，去除杂质。采用大孔吸附树脂分离纯化操作的基本程序大多是：天然产物提取液通过大孔树脂吸附有效成分乙醇溶液梯度洗脱回收溶剂得到提取液浸膏干燥半成品。 大孔吸附树脂工艺对于富集天然产物中的黄酮类、生物碱类、苷类等有效成分是卓有成效的。,（六）膜分离技术,膜分离技术是一项新兴的高效分离技术，已被国际公认为是20世纪末到21世纪中期最有发展前途的一项重大高新生产技术。是利用天然或人工合成的具有选择透过性的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分体系进行分离、分级、提纯或富集的技术。膜分离技术包括超滤、微滤、纳滤和反渗透等。 膜分离技术的应用原理近似机械筛，是以压力为推动力，实现溶质与溶剂的分离，溶剂（水）和其它小分子量溶质透过具有不对称微孔结构的滤膜，大分子溶质和微粒（如蛋白质、病毒、细菌、胶体等）被滤膜阻留，从而达到分离、提纯和浓缩产品的目的。在常温下操作，无相变，能耗低。 采用超滤技术可以滤除天然产物水提液中的相对分子量大于几万的杂质（无效成分），如纤维素、黏液质、树胶、果胶、淀粉、鞣质、蛋白质（少数药材除外）、树脂等成分。,（七）分子印迹技术,分子印迹技术（MIT）是20世纪末出现的一种高选择性分离技术，这种技术是选用能与印迹分子产生特定相互作用的功能性单体，在印迹分子周围与交联剂进行聚合，形成三位交联的聚合物网络，然后，通过合适的溶剂除去印迹分子，在聚合物网络中形成空间和化学功能与印迹分子互补的空穴。整个聚合过程可分为三步：印迹、聚合、去除印迹分子。 例如,在极性溶剂中以丙烯酰胺作为功能单体，以强极性化合物槲皮素为印迹分子，制备了分子印迹聚合物（MIP）。液相色谱实