泌尿系统与男性生殖系统药效学研究的设计和方法,第一节 急性肾功能衰竭药 一、试验设计的医学基础 急性肾功能衰竭(简称ARF)是危急重症，属中医“癃闭”、“关格”、“肾风”等范畴。其临床表现主要是小便点滴而下，或点滴全无，起病往往突然发作。治疗乃根据“腑以通为用”的原则，着重于通。实证宜清湿热、散瘀结、利气机而通水道；虚证宜补脾肾、助气化而达到小便自通的目的。改善少尿、氟质血症和肾小管坏死是治疗ARF药效学的主要研究内容。,二、药效学研究的实验设计 (一)急性肾衰动物模型 l 常用动物模型 (1)大鼠血红蛋白尿ARF模型；以甘油肌内注，24h后即有尿素氮升高，少尿或无尿等类似人的ARF症状。 (2)犬去甲肾上腺素模型：雄性犬麻醉以适当的去甲肾上腺素经侧肾动脉连续滴注，引起肾流量急剧下降，同侧输尿管收集的尿量也相减少等一系列肾衰症状。 (3)犬夹闭肾动脉引起的ARF模型：麻醉犬用外科手术暴露肾动脉夹闭1h，引起的缺血性肾功能衰竭。 (4)汞剂引起的动物ARF模型：以适当剂量的氯化汞静脉注射家兔，皮下或静脉给大鼠，l2日引起肾小管损伤，出现急性肾功能障碍的系列变化。 (5)大鼠抗生素ARF模型：大剂量抗生素(庆大霉素)给大鼠腹腔注射，通过影响肾小管上皮细胞膜脂代谢及抑制线粒休的能量代谢，造成肾小管损害，引起尿量改变及尿蛋白和尿素氮升高等急性症状。,2 观察指标 (1)生化指标：血肌酐(BUN)、血清尿素氮(Scr)水平；24h肌酐、尿素总排出量；24h肌酐清除率。 (2)尿常规检查：24h总尿量；24h蛋白和管型等。 (3)病理形态学检查。 (4)其他可供分析的指标：血清总蛋白和白蛋白；对主要以损害肾小管功能的模型；如庆大霉素ARF模型可选择NAG酶及溶菌酶作为观察指标反映肾小管损伤的严重程度。,3，方法学评价 (1)ARF模型较多，从机制分为缺血性和中毒性。 一般认为大鼠血红蛋白尿性ARF模型二种机制均有，接近于人的创伤性ARF，特别是积压综合征。在此模型早期，肾血管阻力增加，肾血流量减少，肾皮质区域的血管重度收缩，如所试药物可能有类似于异博定的降低肾血管力、增加肾血流量等作用，采用此模型较适当。本模型所用动物价廉易得，方法简便，病变稳定，在定时间内做动态观察，也可用家兔，以便多次采血检查。此模型是新药药效较常用的模型。 (2)家犬去甲肾上腺素及家犬夹闭动脉引起的ARF模型均属缺血性ARF，机制相同，所用动物相同。 (3)汞剂引起的ARF属于中毒性ARF模型。特点为简单易行，病变较稳定，用家兔、大鼠、小鼠作模型动物。,(二)相关药效学试验和机制研究 1，辅助试验 对能反映解除主症有作用的其他试验，如药物的利尿作用、血管扩张作用对高血钾，酸中毒的控制作用，以及药物对其他原因引起的氮质肌症的影响，均可酌情选用。 2作用原理研究 如用水清除率、截流分析实验、肾小管微穿刺技术等探时药物作用部位和功能。这研究对了解新药特点很有意义。 (三)阳性对照药 (1)地塞米松。 (2)维拉帕米(异博定)。,三、急性肾衰动物模型建立方法 (一)大鼠血红蛋白尿ARF模型 1原理 肌内注射甘油后，大鼠肾血流减少，肾小管内皮细胞肿胀，增大了肾血管阻力，血管节段性坏死，外膜纤维化血管自身调节功能丧失，导致肾小球滤过下降。另外，肾小球及肾小管用围纤维蛋白沉积，血臂内血液淤积，血栓形成，血流不畅，导致肾小球滤过率下降，肾小管坏死。 2操作方法 采用体重150250g雄性大鼠，置代谢笼中。纪录正常饮水量从尿量，用药前禁水24h。选体重减轻并有脱水的大鼠以50甘油按10mlkg分别在两侧后肢肌内注射.大鼠自由进食和饮水，般于2h后出现血红蛋白尿，48h形成稳定模型。15日内进行实验。,3造模成功指标和药物疗效观察 (1)24h尿量较对照组明显减少，尿蛋白明显升高。 (2)BUN、Set明显增高，血清总蛋白减少。 (3)血清K、Na增高。 (4)病理学检杳可见明显的肾小管病变。 所试药物的药效可根据用药后对以上指标的改善来评价，结果进行组间比较，统计学处理采用t检验。 4注意点 (1)个别大鼠叫在肌注甘油后，肾脏损害过重而北亡。 (2)禁水24h后体重减轻明显，脱水严重的大鼠选作实验动物效果较好。,(二)犬去甲肾上腺素ARF模型 l 原理 去甲肾上腺素引起肾血管收缩而致肾小球的血流减少，肾小球滤过减少；组织缺血、缺氧加重对肾组织损害从而产生ARF。 2操作方法 取1020kg雄性家犬，以戊巴比妥钠30mgkg，静脉注射麻醉后，于术分离侧输尿管，插入管收集尿液。从肾动脉按每分钟075ugkg，滴注去甲肾上腺素，连续40min停药。14h内可进行实验。对照组用地塞米松或右旋糖酐(静脉注射)。肾衰阴性对照组用等量生理盐水，每组动物至少5只。 3药物疗效的评价指标 (1)尿量及尿常规检查(用药前1h及用药1h、2h、4h后)。 (2)BUN、Scr、血清总蛋白和白蛋白、血清K和Na(药前1h及用药1h、2h、4h后)。 (3)病理学检查。所试药物的药效可根据以上指标的改善来坪价，结果进行检验作组间比较。 4注意点 (1)集尿套管内应预充满温水并防止导臂弯曲而阻碍尿液通畅。 (2)实验前勿给高蛋白饮食(如肉类)，否则影响BUN水平。,(三)犬夹闭肾动脉引起的ARF模型 1操作方法 取10-20kg雄性家犬，以戊巴比妥钠30ugkg静脉汴射麻醉，于术暴露左侧肾动脉，夹闭1h后放开，使血流再通，从侧输尿骨导管收集尿液。肾衰阳性对照组用地塞米松(01mgkg)或右旋糖酐(相对分子质量75000，10mlkg，静脉注射)。肾衰阴性对照组(只手术，不夹闭肾动脉)用等量生理盐水，每组动物至少5只。 2原理、评价指标等 同犬去甲肾上腺素模型。,(四)汞剂引起的动物ARF模型 1原理 一般认为是由于汞离子经肾小球滤过后，被肾小管上皮细胞重吸收，并在细胞内累积与细胞膜和细胞内巯基(一SH)和二硫基(一S一S一)等结合，影响酶活性。受累细胞由于汞硫反应而损害细胞及其膜的功能与结构，细胞呼吸功能丧失，变性坏死，并部分脱落于管腔中阻塞肾小管，使原尿通过受阻。 受损的肾小管通透性增高，原尿漏出并返回肾血管，因而产生少尿、无尿。原尿漏至肾间质，形成间质水肿，压迫肾小管。氯化汞中毒还可引起肾血流重新分布，肾皮质缺血，髓质淤血，肾小管滤过减少，也是引起ARF的原因之。 2操作方法 2kg以上的健康成年家兔，雌雄均可。以氯化汞25mgkg次静脉注射(氯化汞可用生理盐水或蒸馏水配成适当浓度的溶液)。测定前3日的血，尿的尿素氮和肌酐含量，取平均值作自身对照；注射氯化汞后的的5日，每天作同样测定，以后可改为隔天或多日测1次，至肾功能正常。进行尿常规检查。 3注意点 (1)HgCl2溶液必须是新鲜配制。 (2)精确收集24h尿(在收集甜内事先加入少量甲苯，以防腐败)。 (3)实验动物所食饲料、青菜不加限制。,(五)庆大霉素ARF模型 1原理 大剂量氨糖类杭生索(AG)在动物体内大部分以原形从尿中排出，小部分被近端小管吸收，导致药物在肾皮质蓄积。抑制肾皮质细胞溶酶体内的磷脂酶A和C，导致磷脂、磷脂酰肌醉在溶酶体内菖积，溶酶体由于磷脂的沉积，最后破裂而致细胞损伤。此外，AG还作用于线粒体氧化磷酸化，造成肾小管损伤。 2操作方法 Wistar雄性大鼠，体重250300g，腹腔注射庆大霉素140mgkg(体重)，共7日，治疗组动物注射的同时给药物；阳性药用维拉帕米，每大鼠每日灌胃15mgkg(体重)；空白对照则给溶剂。 3评价指标 (1)尿量及尿常规检查。 (2)BUN、Scr，血清总白和白蛋白，血清K和Na。 (3)尿NAG酶反溶曲酶的检查。 (4)病理组织学检查。,第二节 慢性肾功能衰竭药 一、实验设计的医学基础 慢性肾功能衰竭(简称CRF)由于多种慢性肾患发展到晚期，肾实质损害引起肾功能严重损害，体内氮质及其代谢产物潴留，不能维持体内水、电解质及酸碱平衡而引起临床症状，是一危重综合征，祖国医学虽无CRF这个病名，但根据其发病，症状及演变规律，可归纳为“关格”、“癃闭”、“溺毒”、“虚劳”等。患者多见倦怠乏力、气短懒言、纳差腹胀、恶心呕吐、四肢麻木、皮肤瘙痒、腰腿酸软、面色晦暗、肌肤甲错、舌淡有齿痕或色紫暗并有瘀斑、舌苔白滑或厚腻、脉沉弱。综上所述属脾肾气虚证并兼有湿浊或瘀血，故以“健脾益肾，通腑降浊、活血化瘀”法治疗。现代医学则以改善肾功能，促进氮质化合物等毒素的排出，纠正水、电解质和酸碱紊乱，纠正贫血等方法以延缓病程进展。,二、药效学研究的实验设计 (一)对疾病动物模型的治疗作用试验 1常用动物模型 (1)大鼠腺嘌呤CRF模型：大鼠经含050. 75腺嘌吟(adenine)饲料喂养引起的。 (2)大鼠56肾切除的CRF模型：经两期外科手术切除大鼠56肾造成的CRF。 (3)大鼠经液氮冷冻肾脏引起的模型：和模型(2)相似，只是用冷冻代替一期手术的大部分切除。 (4)小鼠电凝摘除肾脏CRF模型：以电烧灼小鼠右侧肾表面，2星期后摘除左肾的外科手术制作的模型。 (5)其他模型，如柔红霉素、阿霉素等致大鼠CRF模型。根据新药可能的作用机制特点选择适当的模型。 以上模型的具体建立方法将在后面叙述，试验治疗的给药途径应与临床一致。,2 观察指标 (1)各组动物血液毒素物质的比较:一般认为尿毒症毒素物质应具备以下几个条件：该物质的理化性质和结构明确；血液中的浓度增高；该物质与CRF特定的临床发现相关；随血液中该物质浓度降低，临床症状和体症改善；在肾功正常的实验动物中能用该物质复制与CRF类似的临床症状。目前已从CRF患者中分离出约200种蛋白质代谢产物，其中100多种物质成分比止常值高，这些毒素物质分为小分子(相对分子质量小于500)，如肌酐、尿素氮、胍类和胺类；中分子(相对分子质量为5005000)；大分子(相对分子质量大5000)，如旁腺索、生长激素等。凡是公认为CRF毒素物质应当是反应新药疗效最主要的指标，目前临床和评价药效多用的观察指标是肌酐、尿素氮。 (2)其他可供分析的指标：各组动物间体重、死亡率的比较；尿量及尿液成分分析(主要为尿蛋白含量的比较)；各组动物红细胞数、血红蛋白和红细胞比积的比较；各组动物间血钠、钙、磷、钾等电解质含量的比较；肾脏组织病理学观察。,(二)相关药效学试验 1血压试验 按常规方法观察药物对大鼠血压的影响。 2利尿试验 用水负荷大鼠或CRF模型大鼠常规方法观察药物有无利尿作用。 (三)阳性对照药 1包醛氧淀粉或爱西特(活性炭) 适用于以吸附肠道毒素来促进毒裹排除、缓解症状的新药。 2，尿毒清颗粒刑 适用降低毒素、改善肾功能为主要功效，用于慢性肾功能衰竭、氮质血症和尿毒症早期的新药。 3地塞米松 地塞米松01mgkg(体重)肌内注射，每日一次，属非特异性作用，可减轻病情。,三、动物模型建立方法 (一)大鼠腺嘌呤CRF模型 1. 原理 高浓度腺嘌吟通过黄嘌呤氧化酶的作用生成极难溶于水的2，8二羟腺嘌吟，后者沉积在肾小管，影响了氮质化合物的排世，导致氮质血症、毒素蓄积从电解质和氨基酸代谢紊乱，最终引起肾功能衰竭。 2制作方法 用含075腺嘌吟(adenine)饲料喂养大鼠，每日投放量约350mgkg(体重)。全部动物自由摄取饲料和饮水。 3造模成功的指标和药物疗效观察 大鼠随着进食腺嘌吟饲料的日数增加而日渐消瘦，畏寒拱背，体毛脱落，生长抑制多尿；血肌酐、尿素氮水平升高(喂饲2星期后可见升高)；中分子物质水平升高；电解质代谢紊乱(高磷、高钾、低钠、低钙等)；氨基酸紊乱(主要为必需氨基酸降低)；贫血。病理学观察表明，肾脏明显增大(第八星期较肾脏大4倍多)，肾组织内有大量腺嘌崎代谢物结晶沉积，大部分肾小管破坏，有淋巴细胞浸润，局部纤维纵织增生。,药物疗效观察： (1)一般观察：动物的体重、尿量、体毛和般活动状况