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二 环境条件,在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件,培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。,温度(temperature),因为温度是植物组织培养中的重要因素,所以植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好,大多数植物组织培养都是在2327之间进行,一般采用25 2。低于15时培养,植物组织会表现生长停止,高于35时对植物生长不利。但是,不同植物培养的适温不同,百合的最适温度是20、月季足25-27、番茄是28。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度,也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28为最好,在120以下,33以上形成率皆最低。 不同培养目标采用的培养温度也不同,百合鳞片在30以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25以下的高。桃胚在25条件进行一定时间的低温处理,有利于提高胚培养成活率。用35处理草莓的茎尖分生组织35d,可得到无病毒苗。,光照(light),组织培养中光照也是重要的条件之一,主要表现在光强、光质、以及光照时间方面 1光照强度(light intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响,从目前的研究情况看,光照强度对外植体及细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说,光照强度较强,幼苗生长的粗壮,而光照强度较弱幼苗容易徒长。 2光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导,培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养,8周后,分化出愈伤组织。但在蓝光下培养,几周后才出现愈伤组织,而唐菖蒲子球块接种15d后,在蓝光下培养首先出现芽,形成的幼苗生长旺盛,而白光下幼苗纤细。 3光周期(light period) 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养,最常用的周期是16h的光照,8h的黑暗。研究表明,对短日照敏感的品种的器官组织,在短日照下易分化,而在长日照下产生愈伤组织,有时需要暗培养,尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。,湿度 (humidity),湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件,容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量,否则,将使培养基干硬,以致不利于外植体接触或插进培养基,导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况,但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻,也会导致植物生长发育受影响。 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发,一般要求70%80%的相对湿度,常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分,导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高,进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时,易引起棉塞长霉,造成污染。,渗透压(penetrating pressure),培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物,因此,而影响到渗透压的变化。通常12个大气压对植物生长有促进作用,2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用,而56个大气压植物生长就会完全停止,6个大气压植物细胞就不能生存。,pH值 (pH value),不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的(表21),大多在5、65左右,一般培养基皆要求5.8,这基本能适应大多植物培养的需要。 pH值适度因材料而异,也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样,后者较高一些。一般来说当pH值高于65时,培养基全变硬;低于5时,琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低pH值(约0.20.3个pH值)因此在配制时常提高pH值0203单位。pH值大小调整可用01M的NaOH和0IM的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高02单位,lml的HCl可使pH值降低02单位。调节时一定要充分搅拌均匀。,不同植物的最适pH值,氧气(oxygen),氧气是组织培养中必需的因素,瓶盖封闭时要考虑通气问题,可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口,但棉塞易使培养基干燥,夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。培养室要经常换气,改善室内的通气状况。液体振荡培养时,要考虑振荡的次数、振幅等,同时要考虑容器的类型、培养基等,第二节 培养基的制备,一、母液(stock solution)的配制和保存 在植物组织培养工作中,配制培养基是日常必备的工作。为简便起见,通常先配制一系列母液,即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液,这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取,而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀,如Ca2+ 和S042+,Ca2+、Mg2+和PO43- 一起溶解后,会产生沉淀,一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解,然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液,其中维生素、氨基酸类可以分别配制,也可以混在一起。母液配好后放人冰箱内低温保存,用时再按比例稀释。,母液的配制方法: 单配法:将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用a:b表示,即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。 混配法:将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量,分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液,浓度可用a mg/L表示,即配制一升培养基吸取该母液a ml. 生长素配制时可先用少量95%酒精助溶。2,4D可用O1molL的NaOH或KOH助溶,加入温水定容。生长素常配成1mgml的溶液贮于冰箱中备用。 细胞分裂素类一般先用少量1N盐配溶解后,再加入温水冷却后定容, 铁盐配法(MS为例):在装有400ml 蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠,溶解后加入3.73g EDTA-Na2,加热使其全部溶解,然后边搅拌边慢慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解,冷却后定容至500ml,置于冰箱中备用。,第三节 培养基的选择,在建立一个新的实验体系时,为了能研制出一种适合的培养基,最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验,对这种培养基做了某些定性和定量的小变动之后,即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基,选择最佳培养基。常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。,一、单因子试验,在单因子试验中由于培养基中其他成分都维持在一般水平上,所以只变动一个因子,就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。例如Ms基本培养基的其他成分和用量都不变,只变动NAA用量对某一培养物生根的影响,这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。 生物学试验不同于物理学或化学试验,最显著的差别是在生物学试验中必需设置对照组与试验组,试验组可以有一组或几组,随试验的复杂性而设置,对照组也可能有一组以上。试验中要求对照组与试验组中的试验个体,即植物组织块或其他培养物,必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方面,尽可能完全一致。以保证试验结果是来源于试验因子,而不是由于试验材料的不一致导致的。 试验中各处理一般都要设有一定的重复,以取得可靠的试验结果。随试验规模和要求不同,大多每个项目要有410瓶,每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。,2种激素5种浓度的实验组合,对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验,试验可采用完全试验方案,也可选用正交设计方案,完全试验方案具有均衡完全的特点,各个因子的每个水平都相互搭配,构成了所有可能的处理组合,如研究NAA和6BA的最佳浓度组合,每个因子各设5个浓度水平(0,0.5,2.5,5,10mgL),这两种因子各种浓度的所有组合,就构成了一个具有25项处理的试验见表33。,二、多因子试验,完全试验方案试验因子越多,处理数越多,试验越复杂,消耗的精力、物力越多。为了减少试验处理,但又能准确全面地获得试验信息,通常采用正交试验。例如,采用正交设计,在使用此表时就可以安排4个因子,3种水平的试验,一共做9种不同搭配的试验,其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多因素搭配在一起的试验,但是在试验结果的分析中,每一种因素所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此,一次系统的试验结果,就可以把问题分析得清清楚楚,用有限的时间取得成倍的收获。在组织培养研究中,可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量,如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。,三、逐步添加和逐步排除的试验方法,在植物组织分化与再生的研究中,在没有取得可靠的分化与再生之前,往往添加各种有机营养成分,而在取得了稳定的再生之后,就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功,在逐步减少时是缩小范围,以便找到最有影响力的因子,或是为了实用上的需要竭力使培养基简化,以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时,也经常用到这种加加减减的简单方法。,四、广谱实验法,在广谱实验法中,把培养基中所有组分分为4大类:无机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示。例如,一个包含中等浓度无机盐,低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段,再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生K素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。,第四章 操作技术,第一节 灭菌和接种 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是:凡是暴露在空气中的物体,接触自然水源的物体,至少它的表面都是有菌的。依此观点,无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表,如整个消化道、呼吸道,即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。 这里所指的菌,包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。茵的特点是:极小,肉眼看不见。无处不在,无时不有,无孔不人。在自然条件下忍耐力强,生活条件要求简单,繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。,无菌的范畴是:经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的),高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部,强酸强碱,化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出:在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多。 菌是指用物理或化学的方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒,它指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死,即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物,所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作,就叫做无菌操作。,常用的灭菌方法,常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施;化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。,湿热灭菌(培养基),培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是:在密闭的蒸锅内,其中的蒸气不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在o1MPa的压力下,锅内温度达121。在此蒸气温度下,可以很
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