,毒理学基础 第八章 外源化学物的致突变作用,第一节 概 述,一、基本概念,变异(variation)-由于遗传物质在自我复制过程 中的偶而失误,或由于个体发育与生存受到变化的内外环境条件的影响,一种物种在个体或历代间的性状出现不同程度的差异.,2.突变（mutation）因遗传结构本身的改变及其引起的变异（可遗传的变异)。 突变可分为： 1）自发突变（spontaneous mutation） 2）诱发突变（induced mutation）,3. 遗传毒理学（genetic toxicology）主要研究环境中的致突变物(包括化学、物理、生物因素)的致突变作用以及人类接触致突变物后可能引起的健康效应. 主要任务:研究环境中的致突变物的致突变作用以及其机制,应用检测系统发现和探究致突变物,提出评价致突变物健康危害的方法.,1）致突变作用（mutagenesis）指外来因素(化学,物理,生物因素)引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且这种改变可随同细胞分裂过程而传递。 2) 致突变物（mutagen）能够引起突变的物质.(遗传毒物, 诱变物),二、遗传学基础 1. DNA与基因结构； 2. 染色质与染色体； 3. 体细胞与生殖细胞； 4. 基因型与表型； 5. 细胞周期与细胞分裂。,第二节 化学毒物致突变的类型,化学毒物致突变类型,基因突变 碱基置换、移码突变 突变 染色体畸变 (结构异常-染色单体畸变 染色体畸变) 染色体组畸变 (数目异常- 非整倍体、 多倍体),一.基因突变： 指基因中DNA序列的改变（点突变)。 1.碱基置换（base substitution） 是指DNA序列上的某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。 1) 转换（transition） 2) 颠换（transversion） 同义突变 错义突变 无义突变,2. 移码突变（frameshift mutation） 指发生一对或几对（3或3的倍数除外)碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。 3. 整码突变 4. 片段突变,二.染色体畸变(染色体结构异常)： 断裂剂(clastogen) 断裂作用(clastogenesis) 拟紫外线断裂剂： 染色单体型畸变，S期依赖断裂剂 拟放射线性断裂剂： 染色体型畸变，S期不依赖断裂剂,三. 染色体数目异常(染色体组畸变): 1.非整倍体细胞增加或减少一条或几 条染色体。( 2n-1, 2n+1, 2n+2) 2.多倍体 细胞染色体数目成倍增加。 (三倍体,四倍体等),第三节 化学毒物致突变作用的机制及后果,一、机制,（一）引起DNA突变 1.碱基损伤 1）碱基错配 2）碱基类似物的取代 3）碱基的结构改变或破坏 4）平面大分子嵌入DNA链,2。DNA链受损 1）二聚体的形成 2）DNA加合物形成 3）DNA-蛋白质交联物形成,(二)引起突变细胞分裂过程的改变(染 色体组畸变的机制) 非整倍体: 不分离、染色体行动滞后、 联 会、着丝粒早熟分离 多倍体: 核内复制、 细胞质分裂障碍,(三) 其它的改变,突变的后果主要取决于化学物作用的靶细胞。 生殖细胞突变 致死性突变 非致死性突变 体细胞突变 肿瘤、致畸作用、衰老、动脉粥样硬化,二、突变的后果,基因库(gene pool)指某一物种在特定时期中能将遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和。（即指一种物种的群体中在生殖细胞内具有、并能传给下一代的全部基因总和。 遗传负荷(genetic load): 指一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平.,第四节 机体对致突变作用的影响,对外来因素的致突变作用,机体自身具有一定的防御功能。 （1）DNA执行高保真度的复制； （2）机体自身的修复功能。,1、DNA损伤的修复功能 1） 光修复 2） “适应性”反应 3） 切除修复 4） 复制后修复 5） 呼救性修复(SOS修复) 2、遗传因素对致突变作用的影响 1）代谢酶遗传多态性 2）修复功能的个体差异,第五节 致突变试验方法,一、致突变试验方法的选择原则 （一）观察的效应终点类型 遗传学终点: 有许多致突变试验所观察到的现象并不能反 映基因突变和染色体畸变或染色体不分离，而仅仅 反映致突变过程中发生的其它事件。将试验观察到 的现象所反映的事件称为遗传学终点.,1983年国际环境致突变物致癌物防护委(ICPEMC）将致突变试验所反映的遗传学终点分为5类: （1）DNA完整性的改变； （2）DNA重排或交换； （3）DNA碱基序列改变； （4）染色体完整性改变； （5）染色体分离改变。,遗传学终点包括：（归纳） 基因突变 染色体畸变 原发性DNA损伤 非整倍体,由于一种致突变试验方法只能反映一个或两个遗传学终点，实际工作中，没有一种致突变试验方法能涵盖所有的遗传学终点，为了避免出现假阴性，故需要用一组试验进行配套检测。,（二）配套试验的原则： 1.遗传学终点齐全； 2.应包括多种进化程度不同的物种； 3.体内、体外试验相结合； 4.应包括生殖细胞和体细胞突变的试验方法。,二、致突变试验中的一些问题,1. 阴性和阳性对照的设立 2. 体外试验的活化系统 S9 3. 致突变试验与致癌试验的关系,4.试验结果在毒理学安全性评价中的作用。 质量控制 a）阴性对照组和阳性对照组的设立 b）盲法观察； c）资料处理； d）实验结果重现性。 阴性结果判定条件 阳性结果判定条件,三、常用的致突变试验方法,（一）鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 （Ames test ） 1. 原理 正向突变 野生型 突变型 回复突变 野生型鼠伤寒沙门氏菌能自行合成组氨酸（his+），在 组氨酸缺乏的培养基中能生长；而突变型鼠伤寒沙门氏菌自 身不能合成组氨酸（his-），在组氨酸缺乏的培养基中不能 生长。如果细菌在受试物的作用下能在组氨酸缺乏的培养基 中生长，则说明受试物使之发生了回变，表明该受试物有突 变作用。,2. 试验菌株 鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株： TA97、TA98 ： 移码突变； TA100： 碱基置换； TA102： 移码突变+碱基置换 组氨酸缺陷（his-） 细菌屏障脂多糖缺陷（rfa 深粗型突变） 结晶紫抑菌试验 切除修复系统缺损（uvrB 突变） 紫外线敏感试验 R因子（pKM101、pAQ1质粒） 抗氨苄青霉素试验、抗四环素试验,测试菌株（TA系列)特性, 剂量设计: * 最高剂量的确定主要取决于受试物对实验菌株的毒性和受试物的溶解度. * 一般最低剂量为0.2g/皿,最高剂量为5mg/皿. * 至少5个剂量,每剂量间隔不超过5倍. * 每剂量3皿. 对照组的设计: * 阴性对照: 溶剂对照 （H2O,DMSO) 未处理对照 * 阳性对照,推荐的标准诱变剂,3.试验方法 平板掺入法 点试验法 预培养法,4.结果评价标准,阳性结果判断标准: 平板掺入法: 受试组回变菌落数阴性对照组回变菌落数的2倍,并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应. 点试法: 如受试物点样纸片周围长出较多密集的回变菌落,与阴性对照组相比有明显区别.,结果报告(平板掺入法) 阳性结果至少重复试验共3次,阴性结果至少重复试验共2次,才能作出判断. 本方法不适合用于杀菌和/或抑菌作用的受试物,不适用于具有妨碍哺乳动物细胞复制系统的受试物.,（二）微核试验（micronucleus test),（三）小鼠精子畸变试验 （四） 染色体畸变分析（细胞遗传学试验） （五）单细胞凝胶(SCGE)试验 慧星试验（comet assay),(六)小鼠淋巴瘤细胞L5178YTK+/-基因正相突变试验,原理 : 在5-三氟胸苷(TFT)参与下，通过评价细胞集落生长率来鉴定受试物诱导L5178YTK+/-小鼠淋巴瘤细胞系正相突变能力。 TK座位位于常染色体上,其基因产物为胸腺嘧啶脱氧核苷(胸苷)激酶（TK）.其作用是通过磷酸化将基质中外源性的胸苷用于DNA合成.如果一个胸苷类似物（如TFT）存在于基质中,也可经TK途径磷酸化掺入DNA中,最终导致细胞死亡。,本试验使用的TK座位杂合子(TK+/-)细胞，它单步正相突变就会形成TK+/-表型，失去TK活性，获得TFT抗性，即能像杂合子一样利用从头合成途径在普通培养基中生长，又能在TFT选择性培养基中存活，此时存活的即为自发或致突变的TK+-集落,.测试用细胞 小鼠淋巴瘤细胞L5178细胞系，源于小鼠白血病细胞，为TK座位杂合子细胞（TK+/-) .操作方法（略） .结果判断（毒理学实验方法与技术p66）,思考题,1突变的定义？化学毒物致突变的类型有哪几种？ 2突变的后果有哪些？致突变与致癌、致畸的关系？ 3致突变试验时为什么需要一组配套试验？选择一组试验时应注意哪些事项？ 4. 体外试验为什么要加活化系统？常用的活化系统是什么？ 6. Ames试验、微核试验、染色体畸变试验的原理和目的是什么？,