第八章,病原学诊断与防治,第一节 细 菌 学 诊 断,细菌学诊断（bacteriological diagnosis）： 检测病原菌及其抗原、产物或核酸 血清学诊断（serological diagnosis）: 检测患者血清中特异抗体, 严格无菌操作，避免标本被污染, 根据不同疾病以及疾病的不同时期采集不同标本, 尽可能在疾病早期及使用抗菌药物之前采集标本, 采集的标本必须尽快送检，多数菌可冷藏送运, 标本作好标记，详细填写化验单,1、标本（specimens） 标本采集与送检过程中应遵循的原则：,一、病原菌检测,显微镜放大法： 普通光学显微镜 (LM) ：分辨率，0.25m 电子显微镜：分辨率，1nm 扫描电子显微镜（SEM）： 透射电子显微镜（TEM）:,2、细菌形态与结构检查：,对于形态与染色上具有特征的病原菌,形态、排列和染色性,扫描电子显微镜（SEM）： 细胞或病毒表面特征,1000 10，000 ,透射电子显微镜（TEM）: 病毒或细胞的内部超微结构,10,000 100,000,普通光学显微镜 (LM) :,草履虫,染色法：染色剂与细菌细胞质的结合 常用：碱性染色剂（有色的阳离子） 酸性染色剂（负染） 单染色法 鉴别染色法： 革兰染色法； 原理、步骤、意义 抗酸染色法 鞭毛染色等特殊染色法,3、分离和鉴定：根据不同疾病采取不同标本如血、尿、粪便、 咽拭子以及脑脊液等进行细菌的分离和鉴定，是确诊细菌性 感染最可靠的方法 鉴定的主要内容： 1）培养特征：根据细菌所需营养、生长条件、菌落特征初步诊断 2）形态特征：细菌的形态、大小、排列、染色及特殊结构 3）生化反应：细菌生化反应的特点可作为鉴别细菌的依据 4）血清学鉴定：已知抗体 未知细菌抗原，以确定细菌的种、型 5）动物实验：测定细菌的毒力，及分离病原菌 6）药物敏感试验；,溶血性链球菌血平板上的溶血,IMViC试验,吲哚试验 + 甲基红试验 + VP试验 + 枸橼酸盐利用试验 +,大肠杆菌 产气杆菌,标本采集,标本送检,初次涂片染色,纯培养后再次涂片染色,细菌的分离培养,挑选可疑菌落进行生化，免疫学，分子生物学检测,4、病原菌抗原的检测 常用于细菌学诊断的免疫学技术 1）沉淀反应 2）协同凝集试验 3）免疫荧光法 4）对流免疫电泳 5）酶免疫测定 6）免疫印迹技术 5、其他检测法：PCR技术检测细菌核酸,二、血清学诊断,原理：用已知抗原检测患者血清或其他体液中未知抗体及其量的变化 应用：抗原性较强的致病菌和病程较长的传染病诊断 通常采取双份血清，如果恢复期或1周后血清抗体效价比早期升高4倍以上时，则可确认为现症感染 常用方法：直接凝集试验（诊断伤寒、副伤寒的肥达试验） 中和试验（诊断链球菌性风湿病的抗O试验） 乳胶凝集试验、补体结合试验,ELISA：技术简便、特异、快速、灵敏，应用广泛,第二节 病毒学诊断,一、标本的采取与送检 注意： 1、对本身带有杂菌或易受污染的标本，要进行病 毒分离培养时，应使用抗生素（青霉素，链霉素等） 2、标本应低温保存并尽快送检 3、血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后2 3周各取1份血清，以便对比双份血清抗体效价的动 态变化,二、病毒的分离与鉴定,以下情况需进行病毒的分离与鉴定 分离病毒对诊治病人有指导性意义 发现新的病毒或对已被消灭的病毒性疾病怀 疑“死灰复燃”时 为鉴别临床上具有相同症状的疾病，以明确 何种病毒感染 检测所用的病毒活疫苗，及时发现回复毒力 的变异株,（一）病毒的分离 1、动物接种 2、鸡胚培养：目前主要用于分离流感病毒,流感病毒初次分离接种于羊膜腔,流感病毒的再培养接种于尿囊腔,3、细胞培养,细胞培养 病毒分离鉴定中最常用的方法 按细胞的生长方式分类： 单层培养 悬浮细胞培养 按细胞的来源、染色体特征和传代次数分类： 原代细胞：来源于动物、鸡胚或引产人胚组织细胞 二倍体细胞：细胞在体外分裂50100代后仍保持2倍染色体数目的单层细胞 常用于人类病毒的分离或病毒疫苗的生产 传代细胞系：多由癌细胞或2倍体细胞突变而来，能在体外持续传代,病毒在培养细胞中增殖的指标,细胞的变化 细胞病变效应 （CPE）：有些病毒在细胞内增殖时引起 的特有的细胞病变：细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落 多核巨细胞（融合细胞）形成：有些病毒如麻疹病毒、 巨细胞病毒等作用于细胞膜，使邻近的细胞融合，形成多 核巨细胞。 胞质或核内包涵体（inclusion body）的形成 狂犬病病毒、巨细胞病毒,1、CPE,正常细胞,病变细胞,巨细胞病毒感染细胞形成的包涵体 猫头鹰眼状,2. 红细胞吸附（hemadsorption, HAd） 流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素（HA），具有吸附脊椎动物（豚鼠、鸡、猴等）红细胞的能力，这一现象称为红细胞吸附。 常用来鉴定具有HA的黏病毒 或副黏病毒的增殖,3.干扰现象（interference）： 某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于 测出的变化（如HAd），但能干扰其后感染的 另一病毒的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE 4.细胞代谢的改变： 病毒感染细胞的结果可使培养液的pH改变。 培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖 的指标,（二）病毒的数量与感染性的测定：,1、蚀斑测定法,2、ID50 或 TCID50,50%组织细胞感染量：病毒感染细胞后，引起 50% 发生死亡或病变的病毒量。,病毒感染单层细胞后，产生的局限性病灶，称蚀斑。 每个蚀斑是由一个感染性病毒体复制，使细胞病变形成的，称蚀斑形成单位（PFU）。 通过计算PFU数量来得出感染性病毒体的数量,（三）新分离病毒的鉴定： 1. 病毒核酸类型的测定 2. 理化性状的检测 3. 形态学观察 4. 血清学鉴定 5. 基因测序和生物对比,三、病毒感染的血清学诊断,原理：用已知病毒抗原来检测病人血清中有无 相应的抗体 中和试验（NT test） 补体结合试验（CF test） 血凝抑制试验（HI test） 凝胶免疫扩散试验,中和试验： 病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验 患者血清中抗体的消长情况,中和抗体：作用于病毒表面抗原的抗体 中和试验是用于人群免疫情况的调查，临床诊断中不常用,补体结合试验： 用已知病毒可溶性补体抗原来检测病人血清中相应的补体抗体。 补体抗原：病毒的内部抗原 补体抗体的出现可作为近期感染的指标,血凝抑制试验（HI, test）: 具有HA的病毒能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，程血凝现象。这种现象能被相应抗体抑制，称HI试验,四、病毒感染的快速诊断,（一）形态学检查 1、电镜和免疫电镜 2、普通光学显微镜检查 包涵体 （二）病毒蛋白抗原检查: EIA （三）特异性IgM抗体的检测 （四）检测病毒核酸: 1、核酸杂交技术 2、核酸扩增技术 3、基因芯片技术,主要是从含有病毒标本及感染机体的血清中检测病毒颗粒、 蛋白抗原、 IgM抗体和核酸,第四节 特异性预防与治疗,三、细菌感染的治疗,第三节 真菌学诊断,细菌产生的抗生素：多粘菌素 按生物来源分类 真菌产生的抗生素：青霉素 放线菌产生的抗生素：链霉素 -内酰胺类 大环内酯类 氨基糖苷类 按化学结构和性质分类 四环类 氯霉素类 人工合成类 其他抗生素类,（一）抗菌药物的种类,（二）抗菌药物的主要作用机制,影响细胞壁的合成（青霉素）,影响细胞膜的功能（多黏菌素）,影响蛋白质的合成（链霉素30S亚基, 氯霉素 50S亚基）,影响核酸代谢（喹诺酮）,影响细胞壁的合成,1、 细菌细胞膜上有6种青霉素结合蛋白（PBP），在肽聚 糖的合成中起重要作用 2、 青霉素（与 D 丙氨酸 结构相似）能竞争性地结合其中的转肽酶，阻滞此酶的功能,青霉素类的抗生素抑制肽聚糖的合成，对生长旺盛的细菌效果明显,四、病毒感染的治疗,五、真菌的治疗,