戊唑醇在葡萄酒酿造过程中的演变,作者国籍：Spain,期刊：食品化学 Received 28 July 2008 Received in revised form 4 April 2009 Accepted 13 April 2009,1,1、文章摘要,本文对酿造葡萄酒中戊唑醇农药残留变化进行了研究，对葡萄、未发酵的葡萄汁、葡萄酒利用气相-离子阱质谱(GCITMS)检测方法进行检测，戊唑醇保留在了酒渣和酒糟以及澄清介质上。在终酒中戊唑醇的减少量是86%。同时通过模拟实验对戊唑醇对酿酒酵母和酒球菌发酵活力影响进行研究，运用LCMS/MS来检测模拟实验中未发酵葡萄汁和葡萄酒中的戊唑醇的残留。结果农残对酒精发酵和苹果酸乳酸发酵无影响，未检出微生物对戊唑醇的降解产物。,2,试验的两个目的：,第一是通过整个试验研究红葡萄酒在加工过程中戊唑醇的残留量的变化。 第二是通过模拟试验来研究戊唑醇残留对酵母菌的酒精发酵和酒球菌的苹果酸乳酸发酵的影响。检测葡萄酒中微生物的存在是否对戊唑醇残留的减少有促进作用。,2.1 葡萄酒酿造试验 葡萄酒酿造试验A和B，各做两个重复，用2007年九月收货的葡萄进行试验。 A组去梗破碎后不添加农药进行葡萄酒酿造试验。 B组去梗破碎后添加农药进行酿造试验，添加戊唑醇的标准品达到3.3 mg/kg（这个水平是欧洲MRL, 2.0 mg/kg的1.6倍多）。 A组和B组的酿造方法相同。,4,2.1.1、葡萄就酿造过程,成串的葡萄称取40kg,总共四份。酿造过程如下：每份去梗破碎的葡萄放入金属容器中进行发酵，添加SO2 (40 mg/L)，仅对B组添加农药，其他不添加，24小时后添加商业酵母，酒精发酵在18-20进行发酵，保持10天，在10-11天，酒精浸渍发酵温度低于18-20， 期间为防止葡萄皮浮起，每天按下两次。在发酵的最后进行压榨，酒和未发酵的葡萄汁转移进另一个金属容器加入酒球菌进行苹果酸乳酸发酵，在酿酒的最后过程进行过滤，添加SO2终止发酵，卵清蛋白进行澄清，最后进行灌装。,5,6,2.1.2. 取样,根据表所述，为了研究不同酿酒步骤对戊唑醇减少的影响，酒精发酵之前对破碎的葡萄取样；在酒精发酵的最后对酒和果渣进行取样；在苹果酸乳酸发酵的最后，对已过滤后的酒样进行取样；经过澄清，对瓶装的酒进行取样。,7,2.2.化学药品,2.2.1. 戊唑醇提取和测定用试剂。 戊唑醇纯度 98%,戊唑醇D6(100mg/l,溶于丙酮，作为内标物)，用于矫正色谱法中的进样误差和质谱检测的响应值。2-乙氧基-1,2-丙二醇、山梨醇、古洛糖酸-内酯用于被分析物的保护剂，溶剂（残留量分析等级）是丙酮，乙腈，蚁酸，超纯水，二氯甲烷，甲醇和甲苯。Nacl，无水硫酸钠，氨基甲酸盐。杀菌剂的标准溶液和被分析物的保护剂在实验开始之前准备好。,8,2.2.2. 模拟葡萄汁试验用到的药品 材料和培养基（蛋白胨，酵母提取物，琼脂和MRS培养基）来自Cultimed。葡萄糖，96%的乙醇，甘油，苹果酸，NaCl，CaCl2，H2SO4 9598%，NaOH，3-5二硝基水杨酸，酒石酸钾钠。,9,2.3. 材料和仪器 2.4 提取步骤 破碎的葡萄(5 g),未发酵的葡萄汁和葡萄酒(各5 mL)的样本在50ml的聚丙烯做的螺旋帽的离心管中进行称量。25ml的二氯甲烷和丙酮(75:25, v/v)加入容器进行超声波浴10分钟来完全混合均匀。NaCl（3g）和无水硫酸钠（12g）加入后混匀5分钟。经过10分钟，4000转的离心分离后，把15ml有机物层转入40ml的瓶中在氮气流中干燥，残留物重新溶于2ml的乙腈液中。 净化 为了将杂质去除干净，进行固相萃取，使用Supelclean Envi Carb-II/PSA SPE固相萃取小柱，用乙腈：甲苯（3;1）5ml活化，将2ml的乙腈提取物上样，被吸附的农药残留用乙腈和甲苯（3;1）20ml进行洗脱到40ml的玻璃瓶中。洗脱液用氮气吹干，最后加入2ml丙酮定容，丙酮中含有3种保护剂(3-ethoxy-1,2-propanediol at 10 g/L; and D-sorbitol and L-gulonic acid c-lactone at 1 g/L; respectively).三种保护剂混合的使用可以弥补基质效应。戊唑醇的D6 (0.1 mg/L)标准液作为内标液也加入，丙酮提取物混匀。最后丙酮提取物放于350L的玻璃注射器加入2ml的小瓶，用于色谱分析。,10,2.5. 戊唑醇的分析检测,实际体系中的样品的测定用气相-离子阱质谱，（其中的进样方式是PTV，内标法） 模拟体系中的样品的农药残留检测用液相-三级四极质谱仪进行测定。（外标法） 糖的测定用3,5-二硝基水杨酸（DNS）方法，葡萄糖作为标准物。乙醇和甘油的测定采用高效液相色谱示差折光检测器进行检测。单位微生物量用干重法。,11,2.6. 模拟试验中微生物的培养和发酵,2.6.1. 微生物 2.6.1.1. (A) 酵母的培养 2.6.1.2. (B)细菌的培养 2.6.2. 酒精发酵试验 三组试验进行：A酵母菌在戊唑醇存在的条件下进行培养。 B酵母菌在没有戊唑醇存在的条件下进行培养。 C在添加戊唑醇条件下未加酵母菌条件下进行。,12,具有主要葡萄酒特性的简单培养基用200 g/L葡萄糖、7 g/L蛋白胨、3.5 g/L酵母提取物，通过过滤0.22m的膜滤器来杀菌。A 、C的培养基中戊唑醇的含量是2 mg/L。B实验含有等来量的乙醇。对于三个不同条件下的试验，将每种配好的溶液平均分成49ml体积的各12份，对于A、B试验添加1ml的酵母菌液，对于C组试验添加1ml的灭菌水。所用的盛有样液的烧杯在20 and 75 rpm的震荡器上培养十三天。每组试验中的样本两两一组，分别于0, 3, 4, 6, 9 和 13 天取出进行单位体积的生物量、还原糖、发酵代谢物（乙醇、甘油）和戊唑醇的测定。,13,2.6.3. 苹果酸-乳酸发酵试验 三组试验进行：A酒球菌在戊唑醇存在的条件下进行培养。 B酒球菌在没有戊唑醇存在的条件下进行培养。 C在添加戊唑醇条件下未加酒球菌条件下进行。 和酒精发酵不同的是戊唑醇的浓度从2mg/L降到0.4mg/L,培养基也改变（1 g/L的葡萄糖、7 g/L蛋白胨、3.5g/l的酵母提取物、5g/l苹果酸和80ml/l的乙醇）。其他的和上述酵母菌的相同。,14,3、结果和讨论,3.1. 分析性能 本实验中为了减少基质效应，在进行农药残留检测时溶剂添加分析保护剂（2-乙氧基-1,2-丙二醇、山梨醇、古洛糖酸），同时在进样时应用PTV的进样方式来减少基质效应。 SLE/SPE/GCITMS和SLE/SPE/LCTQMS的检测方法的性能通过检测的线性范围、精确度、检测限和定量限 绘制的标准曲线是戊唑醇面积/内标物面积的比值对戊唑醇浓度的绘制而成。,15,16,3.2.在葡萄酒加工过程中农药的减少,在B试验中，葡萄先被检测，确定无戊唑醇的残留， 当葡萄去梗破碎之后，添加3.3 mg/kg的戊唑醇的标品，本文选择这个浓度一是为了便于检测到戊唑醇产生的降解物，第二使用纯品是为了防止商品农药中其他杂质的影响。 加入标准戊唑醇农药后一天，发酵正式开始，根据上表中的要求进行取样，在B试验中戊唑醇残留的量如表2，在试验A组中戊唑醇的量一直未检出。,17,18,根据A组和B组葡萄酒酿造过程中葡萄汁密度大小的比较，基本相同，时间周期在1015天。为此可以的出这样的结论：酵母的发酵作用未收到农药戊唑醇的显著影响。 浸泡酒精发酵阶段是戊唑醇存在于酒还是酒渣的关键阶段，从开始的未发酵的葡萄汁到浸泡酒精发酵阶段的最后，戊唑醇分布于液相部分的葡萄汁和固相部分的葡萄渣，戊唑醇没有完全溶解于液相部分这是由于它的水溶性（0.032 g/L),从表2可以看出在酒中的农药残留只有12%，而葡萄酒渣中的农药残留占到88%，表明戊唑醇对悬浮于液相中的固体颗粒有很强的亲和性。,19,对于苹果酸乳酸发酵过程中，戊唑醇对酒球菌具有抗分解的性质，和酒精发酵结束时戊唑醇（0.6 mg/L)的浓度相当。 对于澄清过程，使用卵清蛋白，它可以除去大量的多酚物质，从使就具有较好的口感。经过这个过程，农残除去大约25%。 对于物戊唑醇的降解产物，由于没有降解产物检出，所以降解过程没有写到，文章写到为了进一步确定戊唑醇是否产生降解产物，需要做模拟试验（in vitro assays）来确定戊唑醇是降解了还是吸附到了固体介质上。,20,从上面得出的结果可以说明在葡萄酒的加工过程中，戊唑醇表现出连续的减少。 3.3. 模拟试验结果 尽管用实际酿造葡萄的试验可以有农药残留浓度对微生物的影响，但是由于有固体物质对农药的吸附以及在进行单位生物量的测定，这些固体物质的存在都会影响测定结果，同时由于真正体系物质的复杂导致对戊唑醇的降解产物的检测定性、定量有很大影响。 模拟真正发酵体系的性质，配置的液体培养基来评价戊唑醇对发酵参数的影响。,21,3.3.1. 戊唑醇对酒精发酵的影响,22,23,图标解析：在模拟体系中2 mg/L的戊唑醇的残留量导致糖消耗率的减少，酵母生长缓慢，酒精产生缓慢，同时由于戊唑醇的存在使酵母的最大生物量也降低了。可见戊唑醇的存在对酵母具有毒害效果。酵母的代谢物甘油影响不大，但是酒精的产生速度减慢。和不添加农药的相比，添加农药的这组的酒精的最大产生量晚了4-5天。添加农药的一组最后的酒精的最大浓度高于不加农药的一组，这是由于添加不加农药这组的糖在发酵开始阶段已经消耗了。,24,虽说戊唑醇的残留对酵母有毒害作用，导致单位最大生物量和发酵速度的减缓，然而，对于真正的酿酒体系溶于葡萄汁的戊唑醇有一部分会吸附到悬浮于液相的固体颗粒上，所以溶液中真正的液体农残浓度很低，对酵母发酵的影响很小了 。 本试验为了研究农药的减少不仅由于固体物质的吸附而且还有酵母菌的吸附作用，在发酵过程中不仅对游离于液体中的戊唑醇进行检测，同时对吸附于酵母上的 农药残留量也进行了检测。 结果显示可溶性的戊唑醇的量未发生变化，酵母菌上面吸附的戊唑醇的含量不显著。同时戊唑醇的降解产物未检出，可知酵母菌在葡萄汁发酵过程中不会对戊唑醇产生降解作用。,25,26,3.3.2. 苹果酸乳酸发酵的影响,27,28,结果表明0.6 mg/L的戊唑醇的残留对苹果酸转化成乳酸的影响不显著。两种酸的最终浓度基本相同。和酵母菌一样，酒球菌的存在对戊唑醇的降解产物未检出。,29,4 结论 戊唑醇对悬浮的固体颗粒具有很高的吸附性，在终酒当中戊唑醇的减少比率是86。模拟试验的结果表明 ，在发酵过程中戊唑醇存在不会影响乳酸发酵和酒精发酵。同时，这两个发酵过程也不会通过吸附和降解来影响戊唑醇的量。,30,THE END THANK YOU,31,32,