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Folin-Wu法 定量测定血糖的含量,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,1.氧化供能 2.人体的主要组成成分之一 糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖;转化成脂肪和某些非必需氨基酸等 3.糖代谢紊乱供能障碍一系列代谢变化,糖的重要生理功能:,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,血糖及血糖水平的概念:,血糖:指血液中的单糖:葡萄糖,血糖水平:血浆中葡萄糖浓度,血糖总维持在恒定水平:3.96.7mmol/L,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,血糖的来源和去路,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,血糖测定的目的和意义,临床:血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。 科研:在代谢疾病的研究中,常测定血糖。在某些药物的研究中,也涉及血糖的测定。,调节血糖水平的激素:胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。 血糖水平异常:高血糖及糖尿病;低血糖,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,高血糖症:指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性和病理性之分,临床上最常见的病理性高血糖症是糖尿病。 糖尿病:是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病,系胰岛素绝对不足或相对不足,以高血糖症为基本生化特点。同时伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱,甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,症状随机血浆葡萄糖 11.1mmol/L,或空腹血浆葡萄糖 7.0mmol/L。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。 糖尿病典型的症状是“三多一少”,即多饮、多尿、多食及消瘦,糖尿病的诊断标准,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,血糖的测定方法,测定方法,酶法:(1)己糖激酶法(HK) (2)葡萄糖氧化酶法(GOD法) 特异性高,灵敏度高,干扰因素少,适用于自动化分析,为葡萄糖测定的参考方法,但是试剂较贵,无机化学法: Folin-Wu法,特异性差,有机化学法:邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法 干扰因素多,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。 学会制备无蛋白血滤液。 掌握7200型可见分光光度计的使用方法。,一、目的要求,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,二、实验原理,葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性,与碱性铜试剂混合加热,葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基,Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+(Cu2O)而沉淀。 Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+ (Cu2O) 无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应, Cu2O又把酸性钼酸试剂(Mo6+)还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝 。 Cu2O+酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物 OD420比色 血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比,而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,三、实验仪器,1、25mL血糖管3支;2、血糖管橡胶塞3个; 3、沸水浴小锅1个; 4、100mL锥形瓶2个; 5、电炉1个;6、滤纸1盒; 7、吸耳球2个; 8、7200型分光光度计1台;,血糖管,7200型分光光度计,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,1、标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml) (1)1%葡萄糖母液:称取1.000g葡萄糖,溶于蒸馏水,稀释并定容至100ml。 (2)葡萄糖标准液:取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中,加蒸馏水定容。 2、10%钨酸钠溶液:称取钨酸钠10g,溶于蒸馏水并定容至100毫升。 3、0.33mol/LH2SO4溶液:于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。 4、碱性硫酸铜溶液 A液:无水碳酸钠35g,酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水,稀释定容至1000ml. B液:硫酸铜晶体5g,溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时,A液:B液=9:1混合(体积比),混合液于冰箱中保存(4)。,四、实验试剂,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,5、酸性钼酸盐溶液: 称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,倾入另一较大的试剂瓶中,加溴水0.5ml,摇匀,静止数小时后取上清夜500ml,于1000ml容量瓶中,徐徐加入225ml85%磷酸,边加边摇匀,再加25%硫酸150ml。 置暗处次日,用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml,摇匀,用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。,四、实验试剂,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,1、无蛋白血滤液的制备: 用5ml移液管吸取全血(已加抗凝剂)1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中,加蒸馏水7ml,摇匀,溶血后(血液变为红色透明)加10%钨酸钠1ml,摇匀.。 再加0.33mol/L H2SO41ml,边加边摇,加毕充分摇匀,放置515分钟,至沉淀变为暗棕色(如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴)。 用干滤纸过滤。先倾入少许,待滤纸湿润后在全部倒入,如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。,五、实验步骤,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,2、血糖的定量测定: 取25ml的血糖管3支,编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水(空白管);第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液;用吸管吸取无蛋白血滤液2ml,放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液,同时置于沸水浴中8分钟,取出,在流水中迅速冷却后,勿摇动,各加4ml酸性钼酸盐溶液。 一分钟后,用蒸馏水稀释至25ml,混匀,用7200分光光度计在420nm波长处比色,以空白管调节零点。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,按下式计算100ml全血中所含血糖的含量 m=A1/A0C00.1100 式中: m=100ml全血中含血糖毫克数 ; C0=标准液葡萄糖含量(0.1mg/ml);A1=样品液光吸收值 ; A0=标准液光吸收值 0.1:1ml无蛋白血溶液相对于0.1ml全血,六、结果计算:,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,七、思考题,实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性? 实验中,血糖管有什么作用? 实验过程中,为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管?,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,注意事项: 1.加硫酸、钨酸钠时,要边加边摇匀 2.沉淀由鲜红变为暗棕色,是因钨酸钠与硫酸生成钨酸,在适当酸度时,使血红蛋白变性沉淀,如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊,是因为血液中所加抗凝剂过多,可以加入10硫酸1-2滴,待暗棕色后再过滤。 3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,五、实验步骤,1、无蛋白血滤液的制备:,蒸馏水7ml,摇匀,10%钨酸钠1ml,摇匀,0.33mol/L H2SO41ml,边加边摇,加毕充分摇匀,放置515分(沉淀变为暗棕色) (如不变色,再加0.33mol/L H2SO412滴 ),干滤纸过滤,无蛋白血滤液(每毫升相当于1/10ml全血),20ml锥形瓶,溶血(变为红色透明),用5ml移液管取全血1ml (已加抗凝剂,2、血糖的定量测定:,m=OD1/OD2 C 10 100,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,分光光度计的工作原理,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,朗伯-比尔定律,朗伯定律:A=k1L 比尔定律:A=k2C 朗伯-比尔定律:如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的影响,则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成正比。 A=KLC,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,朗伯-比尔定律应用,A标=KC标L A样=KC样L,标准品法测定未知样品含量,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,7200型分光光度计的操作程序,连接仪器电源线,确定仪器供电电源有良好的接地性能。 接通电源,使仪器预热20分钟。 用键设置测试方式:投射比(T),吸光度(A),已知标准样品浓度值方式(C)和已知标准样品斜率(F)方式。 用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中,打开样品室盖,将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中,盖上样品室盖。一般情况下,参比样品放在第二个槽位中。 将0T校具(黑体)置入光路中,在T方式下按“0T”键,此时显示器显示“000.0”,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,按 MODE键选择A模式 将参比样品拉入光路中,按“0A/100T”键调0A/100T,此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。 当仪器显示器显示出“0.000”A后,将被测样品推入光路,这时,您便可从显示器上得到被测样品的吸光度。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,分光光度计的使用注意事项:,比色皿的清洁程度,直接影响实验结果。因此,特别要将比色皿清洗干净。 装样前处理:自来水反复冲洗蒸馏水漂洗2次待装溶液漂洗2次。 用完后用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿盒中。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,拿放比色皿时,应持其“毛面”,不要接触“光面”。,光面,毛面,若比色皿外表面有液体,应用擦镜纸朝同一方向拭干,以保证吸光度测量不受影响。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,比色皿内盛液应为其容量的2/3,过少会影响实验结果,过多易在测量过程中外溢,污染仪器。,容量的2/3,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,
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