感染性疾病病原体快速诊断,Wenen LIU,2,概 述,感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病,主要表现为发热。 病原体：细菌（含TB）、支原体、衣原体 病毒 真菌 原虫等,Wenen LIU,3,感染的诊断依据,临床表现：感染的全身中毒症状： 畏寒、发热、皮疹等 实验室常规检查：血常规：WBC、DC 影像学检查：X-RAY、B超 病原学检查：染色、培养 血清学检查：抗原或抗体检测,危重病人：临床表现、WBC+DC 不典型,Wenen LIU,5,临床希望第一时间知道的信息,感染或非感染 细菌感染或非细菌感染 是结核感染或普通细菌感染 酵母样真菌感染或丝状真菌感染 白色假丝酵母或其他念珠菌感染 曲菌感染或毛霉菌感染 因为上述感染治疗方法不同,Wenen LIU,6,感染标志物,细菌感染标志物 白细胞计数与分类 血沉 C-反应蛋白（CRP） 白介素-6 降钙素元 内毒素 真菌感染标志物:G试验、GM试验 结核感染证据：夹层杯、T-SPOT,Wenen LIU,7,内容提要,临床常见细菌感染快速诊断技术,结核分枝杆菌的快速诊断技术,1,2,3,临床常见真菌的快速诊断技术,Wenen LIU,8,临床常见细菌感染快速诊断技术,降钙素原检测,内毒素检测,分子诊断,Wenen LIU,9,降钙素原(Procalcitonin PCT),降钙素原是正常人血清中存在的含116个氨基酸组成的糖蛋白，最初由甲状腺细胞产生，血清水平很低。 在非感染或病毒性感染疾病时保持非常低的血清水平，在细菌性感染时含量升高，并与感染程度和预后呈正相关。 PCT含量的变化稳定，并出现在疾病的早期（3-4h）。短半衰期(24h) 国外把 PCT作为最敏感的感染标志。 正常血清水平:100-150pg/ml,Wenen LIU,10,降钙素原 PCT : 分子结构,血清降钙素(CT)的前肽物质 分子量：14.5 kDa 由116个氨基酸组成的糖蛋白质 无激素活性,11号染色体上 的单拷贝基因,转录,甲状腺滤泡细胞,降钙素原前体,内源多肽酶,降钙素原 PCT,分解,细胞内特殊 蛋白酶,正常情况下,降 钙 素,Wenen LIU,11,Linscheid P, et al Crit Care Med 04; 32: 1715-21Endocrinology 03; 144: 5578-84 146: 2699-708,在病毒感染时，大量产生的IFN-，将会抑制PCT的激活及产生.因此，病毒感染时，PCT的浓度将会保持在较低的水平,Bacterial Infection(e.g.Endotoxin),IL-6,IL-6,Wenen LIU,12,细菌感染后PCT快速升高,Kinetics of procalcitonin in iatrogenic sepsis Brunkhorst F.M et al, Intens Care Med 1998,24:888-892,Wenen LIU,13,PCT来源,Left Lane:正常组, 在不存在感染的情况下，甲状腺外CALCI表达被抑制，而主要局限于甲状腺和肺的神经内分泌细胞有一定程度的表达 Right Lane: 脓毒症组,在细菌感染时可诱导全身各种组织多种类型细胞CALCI表达和PCT连续性释放,Wenen LIU,14,PCT动力学,2-3h开始增加； 6-8h快速升高； 12h-48到达峰值； 2-3d 正常 血浆浓度在0.05ng/ml-1000ng/ml 半衰为15-20h左右,且不受肾功能影响,Wenen LIU,15,PCT检测方法,快速半定量法（PCT-Q） 全自动快速定量法（VIDAS),Wenen LIU,16,快速半定量法（PCT-Q）,样本：200l血清/血浆 结果：30min,同胶体金免疫层析法，即在标准品上结合有胶体金的小鼠单克隆抗降钙素抗体和绵羊多克隆抗降钙素抗体，待检标本加上后，示踪元素即与标本中的PCT结合，形成一个“三明治式”的复合物，然后通过发光比色判断PCT浓度 当PCT浓度0.5g/ml时，夹心复合物呈红色带，颜色深浅与样品中的PCT浓度成正比例，未结合的示踪物扩散到对照区，结合并产生了红色的对照带。,Wenen LIU,17,全自动快速定量法,仪器：法国梅里埃公司VIDAS全自动酶联荧光分析仪及配套试剂 标本要求：静脉抗凝血 注意无菌操作，使用新鲜标本，如果4小时内不使用，应将标本放置-20保存。 血浆中的PCT非常稳定，收集标本24h后，PCT浓度在室温下大约下降12，在4大约下降6,Wenen LIU,18,PCT用于细菌感染和脓毒症诊断是一种非常有价值的标志物,细菌感染/脓毒症诊断及严重程度判断 脓毒症治疗效果监测及预后评估 抗生素的有效管理,Wenen LIU,19,细菌感染诊断及严重程度判断,脓毒性休克,严重脓毒症,系统性感染(脓毒症),局部感染,正常值,PCT的浓度随感染的扩散和感染严重程度的加重而升高,Wenen LIU,20,脓毒症患者治疗效果及预后监测,(n=109),F. Stber, University Bonn, Lecture at ISICEM, Brussels 2001,通过PCT不断在体内衰减，反映出抗生素治疗策略的成功,随着患者对抗生素治疗的响应，引起了PCT血中浓度水平的典型变化过程,AB-antibiotics,Wenen LIU,21,抗生素有效管理,Wenen LIU,22,PCT的临床应用,急诊 住院病房 外科手术 血液科 内科ICU 外科ICU 儿科急诊 儿科病房 儿科ICU 新生儿科,严重细菌感染或脓毒症的检测（鉴别诊断） 疾病或治疗反应的监测 局部与全身性感染 脓毒症的诊断和监测 新生儿脓毒症的检测,Wenen LIU,23, 生理性一过性峰值 创伤后炎症综合症: 多发性创伤, 大面积烧伤, 大手术后 (心脏, 移植, 腹部) 使用致炎细胞因子治疗后 (OKT3, 注射 TNF, IL-2, 抗淋巴细胞球蛋白) 某些肿瘤 (甲状腺髓样细胞癌, 肺小细胞癌和支气管癌) 长时间循环衰竭 (心源性休克, 出血性休克, 热休克),PCT水平增加但没有系统细菌感染的几种情况,Wenen LIU,24,感染早期 (- 6-12 小时后重复检测!) 亚急性心内膜炎 局部感染,细菌感染而PCT不升高的情况,Wenen LIU,25,对PCT检测的影响,受以下因素影响 * 甲状腺功能 是功能性甲状腺髓样癌的肿瘤标志物 * 肾功能 严重肾功能受损者中水平较高 不受以下因素影响 * 类固醇药物 * 自身免疫性疾病 * 年龄、性別 * 免疫功能低下状态:肝硬化、HIV感染,Wenen LIU,26,细菌内毒素,Wenen LIU,27,Wenen LIU,28,细菌内毒素检测,原理：仪器检测试管内反应物的光密度OD值，取当OD上升到0.02的点的时间作为反应时间，该点在反应曲线上的位置为浊度开始快速变化的时期，该取值能够快速、稳定的获得反应时间，从而判断内毒素的含量,动态浊度法,Wenen LIU,29,仪器和试剂,BET-24A细菌内毒素分析仪 MB-80微生物快速动态监测系统,Wenen LIU,30,标本要求,患者早上尚未进行药物静脉治疗时: MB-80：“无热源真空采血管”,静脉抗凝血 ，采血量2-4ml ，30min内送检 BET-24A：抽取1mL静脉抗凝血，配1mL1号处理液 其它体液如脑脊液胸腹水与血标本要求相同。 注意无菌操作,Wenen LIU,31,内毒素活性定量检测意义,G-所致脓毒症早期鉴别诊断 指导抗生素正确使用 判定抗感染治疗效果 帮助判断患者的预后,Wenen LIU,32,内毒素定量检测的适应症,各种急、慢性病理性发热患者 各种类型“中重度感染、肝病、休克、肠道疾病、脏器功能衰竭、大手术术后”患者 慢性疾病长期卧床、免疫力低下患者 急诊及ICU病房收治的生命体征不稳定的患者,Wenen LIU,33,分子诊断技术检测致病菌,PCR技术扩增16srRNA基因鉴定常见致病菌,革兰阳性球菌,革兰阴性杆菌,mecA基因,VanA/VanB基因,PBP2b基因,PCR扩增耐药 基因特异性基因,ESBLs基因,AmpC基因,碳青霉烯酶基因,mecA：耐甲氧西林葡萄球菌属（MRS）特异性基因 Van A VanB ：耐万古霉素肠球菌（VRA）特异性基因 PBP2b ：青霉素不敏感肺炎链球菌（pNSSp）特异性基因 ESBLs基因：主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXA AmpC基因包括质粒介导型和染色体诱导型。其中前者主要包括MOX、CMY、DHA、ACC、ACT、FOX等亚型，后者主要包括： ADC。 碳青霉烯酶基因：A类酶，以KPC为代表；金属酶，以IMP、VIM、NDM为代表；D类酶，以OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-48为主。,Wenen LIU,34,16S rRNA具有多拷贝多信息的特点,Wenen LIU,35,结核分枝杆菌的快速诊断,是引起结核病的病原菌。它可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。 结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。 结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2-4周长成肉眼可见的落菌。 抗酸染色法是检测TB的传统方法，但存在假阳性 因此，快速诊断对TB至关重要。,Wenen LIU,36,结核感染现状,全球范围内结核病疫情急剧恶化 结核病与艾滋病同时流行 结核菌耐药现象益发严重 人口大规模流动 我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国 结核菌感染率44.5% 新发活动性结核患者130万/年 死亡13万/年 早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键 常规实验室诊断结核病方法阳性率不到60%,Wenen LIU,37,全球结核疫情,Wenen LIU,38,结核检测方法,一、现有实验室常规检测技术 细菌学诊断 涂片、培养 免疫学诊断 抗原、抗体胶体金 分子生物学诊断 PCR 二、其它检测技术 PPD（TST）实验 影像学检查,Wenen LIU,39,结核分枝杆菌的快速诊断,Wenen LIU,40,结核夹层杯技术,原理：通过专用消化灭活液消化组织细胞和粘蛋白等，将结核杆菌裸露出来，并结合高速震荡，使痰标本充分液化而有利于其中的抗酸杆菌沉淀于特制彭氏杯底部的菌膜上，在夹层杯中直接抗酸染色、干燥，并用取片针顶出内底，经封片等步骤后，镜下检测抗酸杆菌。,Wenen LIU,41,检测流程示意图,Wenen LIU,42,镜下比较,图2. 夹层杯法（新方法）：菌量多，背景清晰，易于观察,图1. 直接涂片法（传统方法）：菌量少，背景不清晰,Wenen LIU,43,夹层杯诊断技术的优点,阳性率高,背景清晰，易于观察,易于标准化,检测速度快,生物安全性好,夹层杯诊断 技术的优点,Wenen LIU,44,结核夹层杯技术,标本要求： （1）痰液要求新鲜，留取清晨深咳出的第一口痰液，留痰时，患者以清水漱口次，然后用力咳出气管深处的痰 （2）用氢氧化钠处理完全。 临床应用：用于结核分枝杆菌的初筛,Wenen LIU,45,结核感染T细胞检测技术,是以ELISPOT技术 检测结核感染的新方法 ，ELISPOT是近20 年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术，是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一。,Wenen LIU,46,原 理,结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8。 结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的活化T淋巴细胞，这些淋巴细胞在体外再次受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌-干扰素，通过检测 体外分泌的IFN-来诊断是否存在结核感染。,Wenen LIU,47,活动性结核与潜伏感染,接触活动性结核病患者,暴露程