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垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶(活性染色鉴定法),实验目的:,理解同工酶的概念及遗传学意义 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色,同工酶 是指能够催化相同的化学反应,但酶分子结构、理化特性乃至免疫 学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达 的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同。 本实验做的是乳酸脱氢酶(LDH)的分离鉴定。,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理,天然状态生物大分子进行的电泳,利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异,而在电场中泳动的速度和方向不同,达到分离的目的。 多数蛋白质的pH在中性偏酸性范围,通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳,蛋白质分子带负电荷,以不同速度向阳极迁移,称为阳极电泳; 对于一些碱性蛋白,使用酸性缓冲系统进行电泳,蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移,称为阴极电泳。,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的样品,分子量小,分子量大,电源,电泳过程中分子迁移的规律,小分子走在前头,大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型,相同孔径的凝胶、缓冲系统,是利用蛋白质分子的主要靠电荷和分子筛效应进行分离。,不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式,在电泳分离过程中,由于浓缩胶的堆积作用,可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带,对样品进行浓缩,浓缩效应,然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离,既存在电荷效应,也有分子筛效应。,不连续系统,连续系统,一、动物组织的样品的获取 二、试剂的配制、仪器的准备 三、分离胶(30分钟) 四、浓缩胶(20分钟) 五、电泳(2-3小时) 六、染色(30分钟) 七、观察结果,实验流程,1.凝胶储备液: A储备液: pH8.9 TrisHCl缓冲液:1 M HCl 48ml,36.6g Tris,加 双蒸水到 80ml,调节pH到8.9定容到100ml。 B储备液 : pH6.7 TrisHCl缓冲液:1 M HCl 48ml,5.98g Tris,加双蒸水到80ml,调节pH到6.7定容到100ml。 C储备液: 分离胶储备液(30% Acr/Bis):30g Acr,0.8g Bis,用双蒸水定容到100ml,备用,4存放可以保存1个月。 D储备液: 浓缩胶储备液:16g Acr,4g Bis,用双蒸水定容到 100ml,备用,4可以保存1个月。 E储备液: 10% Aps(W/V):1g定容到10ml,-20保存。 F储备液: 40%蔗糖:40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。 TEMED,一、试剂:,2.电泳缓冲液: Tris6.0g,28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3,定容到1000ml,使用 时稀释10倍。,3.乳酸脱氢酶染色剂的配制 1M 乳酸钠 0.5ml NAD 25mg PMS 2mg NBT 15mg 0. 2M TrisHcl溶液(PH8.0)2ml 去离子水定容至50ml,器材:,夹心式垂直板电泳槽,梳子,直流稳压电源(电压300-600V,电流50-100mA),移液枪(各种量程),烧杯(100mL),培养皿,1.电泳槽 2.梳子 3.制胶器 4.夹胶框 封胶条,1,2,3,4,取材:鲫鱼若干条,解剖取眼、鳃、肺、肝、肠、肉、卵 、心脏,放入冰箱保存。 提取酶:取不同组织块,加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需4预冷,组织重量(g)与缓冲液体积(mL)之比为:5。用研钵研磨充分。浆液4离心约30分钟,15000转分钟。 取上清液至新管,吸取其中150ul样品,加100ul 甘油和10ul溴酚蓝,混匀之后即可点样。,二、样品的制备,三、分离胶的制备,配方表,TEMED最后一个加入,轻轻混匀,操作迅速。胶高度距样品凹玻璃板下缘约1cm,用移液枪在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气,并使胶面平整。 水与凝固的胶面有折射率不同的界限,用滤纸吸去多余的水。,四、浓缩胶的制备,TEMED最后一个加入,轻轻混匀,操作迅速。浓缩胶液高度到凹玻璃板下缘0.5cm左右,然后插入样品梳,注意不要产生气泡。约30分钟后,凝胶完全。 小心拔出样品梳(两端同时向外拔)。,配方表,点样,加样,样品迁移方向,五、电 泳,电压和电流:电压180V, 电流流1830mA; 溴酚蓝跑至分离胶末端,电泳结束。,六、染色与观察,揭去上面长型玻璃板,凝胶从短型玻璃板上剥离,慢慢地把胶板冲入白瓷盘或大培养皿内,避光于37度摇床中染30min。 观察拍照,m:肌肉(muscle);l:肝脏(liver);k:肾脏(kidney);s:脾脏(spleen);h:心(heart); e:眼睛(eye);f:鳍(fin);g:鳃(gill);b:脑(brain),思考题:,根据实验过程的体会,总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳?哪些是关键步骤? 为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液?分别有何用途?,谢谢,附:分离胶、浓缩胶配方,
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