2020/8/11,.,1,欢迎同学们学习实验诊断学,2020/8/11,.,2,感染性疾病的实验诊断-药敏试验及耐药检测,2020/8/11,.,3,2020/8/11,.,4,重点掌握,1,常用的药敏试验方法,2,药敏试验结果表示及其临床意义,2020/8/11,.,5,药敏结果的表示及其临床意义,耐药菌检测试验,抗微生物药物敏感性试验,耐药机制,耐药菌历史,主要内容,2020/8/11,.,6,Antibiotic Resistance A Global Problem,1961 MRSA 1967 PRSP 1983 ESBLS 1986 VRE 1988 MBL 1997 VISA 2002 VRSA Emergence Spread,2020/8/11,.,7,耐药机制,1、遗传学机制 染色体介导的耐药为细菌本身所固有的耐药，一般具有种属特异性，如肠球菌耐头孢菌素，革兰阴性杆菌耐万古霉素等。 质粒介导的耐药耐药基因易于传播，目前该类耐药在临床上占有重要地位。如由质粒介导的产超广谱-内酰胺酶（ESBL）的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。,2020/8/11,.,8,2.生物化学机制 产生灭活酶或钝化酶使抗生素失活。如-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰基转移酶。 作用靶位的改变使抗生素失去作用位点。如MRSA产生青霉素结合蛋白2a。 主动外排机制如铜绿假单胞菌其外膜存在着独特的药物泵出系统。 细菌生物膜的形成。,耐药机制,2020/8/11,.,9,2020/8/11,.,10,抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility test AST）,简称药敏试验，是指在体外测定抗菌药物抑制或杀菌的能力的实验 药敏试验用抗菌药物的分组 CLSI将抗菌药物分成A、B、C、U、O、Inv六个主要组别 A组（一级试验并常规报告药物） B组（一级试验，有选择报告药物） C组（补充试验，有选择报告药物） U组（仅用于泌尿道的补充试验药物） O组（有适应症，不允许常规试验并报告药物） Inv组（处于研究阶段，未被FDA认可药物）,常规药敏试验报告药物为前四种,2020/8/11,.,11,肠球菌 A组：氨苄西林、青霉素 B组：达托霉素、利奈唑胺、奎奴普汀/达福普汀、万古霉素 C组：高水平庆大霉素、链霉素 U组：环丙、左氧、诺氟沙星、呋喃妥因、四环素,2020/8/11,.,12,铜绿假单胞菌 A组：头孢他啶、庆大霉素、妥布霉素、哌拉西林 B组：阿米卡星、氨曲南、头孢吡肟、环丙、左氧、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦，替卡西林 U组：洛美或氧氟沙星、诺氟沙星,2020/8/11,.,13,常用药敏试验的方法,体外AST包括： 抑菌试验：纸片扩散法 稀释法 E-test 联合药敏试验 全自动药敏检测系统,2020/8/11,.,14,纸片扩散法（改良Kirby-Bauer法，K-B法）,将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。 根据CLSI标准，对量取的抑菌圈直径判断病原菌对该药物的敏感S/中介I/耐药R。,下一张有视频呦！,2020/8/11,.,15,源 ,2020/8/11,.,16,2020/8/11,.,17,纸片扩散法操作简易，结果直观易于理解，但非定量结果，且对慢生长菌和扩散慢的药物纸片法不适用。,2020/8/11,.,18,稀释法 Dilution antimicrobial susceptibility test,直接测定抗菌药物的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC) 稀释法包括两种：肉汤稀释法和琼脂稀释法。 基本原理：在肉汤或琼脂中将抗菌药物进行一系列（倍比）稀释后，定量接种待实验菌，在合适的温度下孵育一定时间，待检菌肉眼未见生长的最小药物浓度，即为该药物对待检菌的最低抑菌浓度。 试验菌的结果报告可用MIC(g/ml)数值或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。,2020/8/11,.,19,仪器,手工,2020/8/11,.,20,浓度梯度纸条扩散法（E test）,是一结合稀释法和扩散法原理对细菌药敏试验直接定量的技术。 将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度(IC)，它与MIC呈高度相关。二者直接相对应，CLSl的 MIC折点值适用于E试验。 具体操作视频请点击这里,要连接网络才能观看呦,2020/8/11,.,21,2020/8/11,.,22,联合药敏试验,此实验是为了了解两种抗菌药物联合应用时的抗菌效果。 联合药敏试验的结果可以表现为无关、拮抗、相加、协同。 协同作用是临床和实验室期盼的结果。 协同用药最典型的例子是青霉素或其同类物与氨基糖苷类抗生素联合治疗肠球菌感染心内膜炎。,2020/8/11,.,23,抗菌药物联合应用目的在于： 治疗单一用药可能不能控制的混合感染 治疗单一抗菌药物不能有效控制的严重细菌感染 治疗病因未明的严重感染 预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生 减少药物的毒性反应,2020/8/11,.,24,耐药菌检测试验,1、直接内酰胺酶试验 目前多采用色原法，以头孢硝噻吩为底物，直接与试验菌作用，纸片由黄色变为红色为阳性。 检测阳性结果表明：该细菌对所有对青霉素酶不稳定的青霉素（包括青霉素和广谱青霉素）耐药。需要对葡萄球菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等常规检测。,2020/8/11,.,25,2、超广谱内酰胺酶的检测（extanded spectrum beta-lactamases, ESBLs） ESBLs由革兰氏阴性杆菌产生，质粒编码，其活性可被内酰胺酶抑制剂抑制，可通过转化、转导、接合、转移等方式传递，易于造成耐药菌流行。 检测包括纸片法筛查和确证试验。产ESBLs的克雷伯菌属、大肠埃希菌和奇异变形杆菌应报告对所有青霉素类、头孢菌素类（包括头孢吡肟）以及氨曲南耐药，但不包括头霉素、碳青霉烯类和含-内酰胺酶抑制剂的复合制剂。,2020/8/11,.,26,肠杆菌科细菌ESBLs的检测,2020/8/11,.,27,KPC酶能水解除头霉素外的各种内酰胺类抗生素，可由肠杆菌科细菌产生。 改良Hodge试验,3、KPC（Klebsiella pneumoniae carbapenemase）酶的检测,2020/8/11,.,28,4、耐甲氧西林葡萄球菌（methicillin resistance staphylococci, MRS）筛选 MRS多是MecA基因编码了对-内酰胺类药物低亲和力的蛋白PBP2a，取代了固有的青霉素结合蛋白PBPs。 MRS的简便检测方法是用头孢西丁纸片扩散法，要基于头孢西丁的结果报告苯唑西林敏感或耐药。 MRS不论其体外药敏试验结果如何，其对所有的-内酰胺类药物和-内酰胺/-内酰胺酶抑制剂均无临床疗效；绝大多数的MRS具有多重耐药性，包括氨基糖苷类、大环内脂类、四环素类。 临床治疗MRSA引起的感染首选万古霉素。,2020/8/11,.,29,葡萄球菌mec-A介导的耐药性检测,头孢西丁,2020/8/11,.,30,5、耐青霉素肺炎链球菌检测试验（penicillin resistance streptococcus pneumonia, PRSP） K-B法 OX19 mm时做青霉素MIC2 g/ml,2020/8/11,.,31,6、高水平氨基糖苷类耐药的肠球菌（high-level aminoglycosde resistance, HLAR） K-B法 庆大霉素120g，出现中介结果（7-9 mm）需补做MIC进行确证。,2020/8/11,.,32,7、万古霉素耐药的肠球菌（vancomycin-resistant Enterococcus） VRE 对万古霉素耐药主要有5种表型VanA、VanB、VanC、VanD和VanE，除VanC为天然耐药外，其余均为获得性耐药。VanA、VanB可通过质粒将耐药性传递给其他肠球菌或其他种类的细菌，若传递给MRSA，则会导致VRSA的出现。 VRE的简便检测方法是用纸片扩散法，对于中介的结果（15-16mm）需补做MIC。,2020/8/11,.,33,8、克林霉素诱导耐药试验（D-实验） 克林霉素能被红霉素诱导产生耐药，靠近红霉素纸片的克林霉素纸片抑菌圈出现“截平”现象，像字母D。 检测葡萄球菌,2020/8/11,.,34,药敏试验结果的表示及其临床意义,结果的表示方法只是对抗菌药物临床治疗效果的一种预测。 敏感(susceptible,S)：表明该菌株所致感染可使用此种抗微生物药物常规剂量进行治疗，除非存在禁忌证。 耐药(resistant,R)：耐药是指即使使用大剂量的抗菌药物治疗时，该抗菌药在感染部位也不能抑制该感染菌生长。,2020/8/11,.,35,中介(intermediate,I)： 抗菌药对感染菌的MIC接近该药在血液和组织中通常可达到的浓度，感染菌的临床应答率可能低于敏感菌。 意味着某些药物在生理浓集的部位(如尿液中的喹诺酮类和内酰胺类)具有临床效力，或者可用。 若某药在高剂量使用时是安全的(如内酰胺类)，则中介意味着高于通常剂量的药物进行治疗可能有效。 中介还意味它是一个缓冲区，避免微小的、未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误，特别是对那些药物毒性范围窄的药物。,药敏试验结果的表示及其临床意义,2020/8/11,.,36,剂量依赖敏感(susceptible-dose dependent,SDD) 是指抗菌药对感染菌的MIC接近该药在血液和组织中通常可达到的浓度，感染菌的临床应答率可能低于敏感菌；当高剂量使用该药仍然安全时，则高剂量给药可能有效。这个概念主要用于真菌的药敏试验，类似于细菌药敏试验的“中介”。,药敏试验结果的表示及其临床意义,2020/8/11,.,37,不敏感(nonsusceptible,NS) 当某新的抗菌药问世时，由于尚未发现耐药株，故早期的解释标准只有敏感折点；当某个分离株的MIC值高于该敏感折点时，就报告为不敏感。,药敏试验结果的表示及其临床意义,2020/8/11,.,38,简而言之： S 表明推荐的抗菌药物可以使用，可能达到临床效果； I 意味着这个范围的抗菌药物在常规剂量下疗效不理想，高浓度下可能有效； R 意味着此种情况下抗菌药物不能用于此菌株的治疗。,药敏试验结果的表示及其临床意义,2020/8/11,.,39,SUMMIT,常用的药敏试验方法：纸片扩散法、稀释法、E-test、联合药敏试验、全自动药敏检测系统 药敏试验结果表示及其临床意义 S 表明推荐的抗菌药物可以使用，可能达到临床效果； I 意味着这个范围的抗菌药物在常规剂量下疗效不理想，高浓度下可能有效； R 意味着此种情况下抗菌药物不能用于此菌株的治疗。 SDD 真菌的药敏试验，类似于细菌药敏试验的“中介” NS MIC值高于该敏感折点时，就报告为不敏感,2020/8/11,.,40,参考文献,药理学. 人民卫生出版社 第2版. 实验诊断学. 人民卫生出版社 第2版. 实验诊断学. 北京大学医学出版社 第3版. 临床微生物学检验. 人民卫生出版社 第5版. 全国临床检验操作规程. 人民卫生出版社 第4版. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. CLSI 27