干扰素的生产工艺,中文名称： 干扰素 英文名称： interferon;IFN 药物类别： 抗肿瘤药，抗病毒药 所属类别： 生物反应调节剂,干扰素简介,70年代中期人们发现慢性乙型肝炎患者自身产生干扰素的能力低下，在应用外源性干扰素后，不仅产生了上述抗病毒作用，同时可以增加肝细胞膜上人白细胞组织相容性抗原的密度，促进T细胞溶解感染性肝细胞的效能 .,现状,目前可供临床选用的干扰素种类很多。例如国产重组 IFN1型和IFN2型，进口的干扰能（IFN2b）、罗扰素（ IFN2a）、惠福仁（类淋巴母细胞干扰素）及组合干扰素等等。,类别,各种亚型的干扰素-（含1或2或2a或2b）疗效近似；干扰素-（IFN）也有相似效果，但它在肌肉组织中易被灭活。干扰素-制剂进入血液后，稳定性差，确切疗效尚在观察中，但可作为干扰素- 的替代制剂。,什么是干扰素（IFN）?,干扰素是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，通过刺激网状内皮系统（人体免疫系统的一种）、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白。这种蛋白具有多种生物活性，包括抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化作用。,干扰素的相对分子质量小，对热稳定，4可保存很长时间，-20可长期保存其活性，56则被破坏，pH（酸碱度）210范围内干扰素不被破坏。人体自然就能产生干扰素，经一定的制剂加工过程也能制造成药物-干扰素制剂。,药理作用：,1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，它一般为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。 2.抑制细胞增殖。干扰素抑制细胞分裂的活性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性比正常细胞大5001000倍。干扰素抗肿瘤效果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。,3诱导细胞凋亡：干扰素可以诱导肿瘤细胞凋亡，从而杀灭肿瘤细胞。 4.干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用。,作用机制 :,干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应。干扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。,适应症：,1.用于多种恶性肿瘤，包括毛细胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期转移性肾癌及胰腺恶性内分泌肿瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。 2.与其他抗肿瘤药物并用。 3.作为放疗、化疗及手术的辅助治疗剂。 4.病毒性疾病的防治。,不良反应：,1.全身反应主要表现为流感样症状，即寒战、发热和不适。 2.骨髓抑制在用药中可出现白细胞、血小板和网状红细胞减少。,3.局部反应部分患者在注射部位可出现红斑，并有压痛，24小时后即可消退。 4.其他脱发、皮疹、血沉加快、嗜睡、一过性肝损伤。偶见过敏性休克，用药前作过敏试验。,临床上常用的干扰素有哪些制剂,自然干扰素 人体白细胞重组干扰素 复合干扰素,相关药物国内生产企业,1.1b干扰素 中国预防医学科学院 卫生部长春生物制品研究所 卫生部上海生物制品研究所 深圳科兴生物制品有限公司（赛若金） 2.人2a干扰素 卫生部长春生物制品研究所 广州医学院 沈阳三生制药股份有限公司（因特芬） 海南新大洲药业有限公司（贝尔芬） 浙江东阳市吴守联合生物技术研究所 深圳科兴生物制品有限公司 武汉天奥制药有限公司（栓剂）,3 .人2b 干扰素 长春生物制品研究所 安徽安科生物高科技有限公司(安达芬) 丽珠集团苏州新宝药厂（隆化诺） 哈尔滨金亚哈尔滨生物制品有限公司（利能） 上海华新生物高技术有限公司 天津华立达生物工程公司 苏州新良药厂 4. 人干扰素 上海生物化学研究所 中国预防医学科学院 卫生部上海生物制品研究所 第二军医大学 上海克隆生物高技术有限公司 珠海丽珠制药有限公司,干扰素生产工艺路线:,路线1： 体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞 1989年：IFN-n3/Alferon，批准上市 产量低：1g IFN，需要 3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性,路线2：,人源转化细胞系培养生产工艺： 1999年：IFN -n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点： 活性低，退出临床应用。,路线3：,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺: 上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。,路线4：,动物无限细胞系培养生产工艺： 上市产品：rhuIFN -1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格,路线5：,基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺： 宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） 上市产品：IFN -2b/安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子 结构和生物活性 工艺特点： 发酵周期短：几个小时 无需变性、复性过程，获得有活性产品 纯化过程：淘汰抗体亲和层析,基因工程假单胞杆菌的构建与保藏,基因工程假单胞杆菌菌种建立： 第一步：干扰素-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建,第一步：干扰素-2b基因的克隆,制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR， 基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。,第二步：表达载体的构建,IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体,第三步：工程菌的构建,转化假单胞杆 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种,菌种库的建立与保藏,QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 菌种检查合格后，方可投产。,干扰素-2b的发酵工艺过程,摇瓶培养：,取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶培养：30，pH7.0，250 r/min，182h 检测：OD值和发酵液杂菌检查。,种子罐培养：,接种：接入50L种子罐，接种量10%。 培养：30，pH7.0。 控制：级联调节通气量和搅拌转速 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。,发酵罐培养：,接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。 控制：级联调节通气量和搅拌转速。 前4h：30，pH7.0，DO为30%。 4h后：20，pH6.0，DO为60%，56.5h。 终点控制：OD值达9.01.0，5冷却水快速降温至15以下。 检测：发酵液杂菌检查,菌体收集：,连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。 菌体保存：20冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。,干扰素-2b分离工艺过程,菌体裂解 预处理 离心 初级分离,1.菌体裂解：,裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎20菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，210，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。,2.预处理-沉淀：,加絮凝剂聚乙烯亚胺: 210，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。 加凝聚剂醋酸钙溶液: 210,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。,3.离心：,连续流离心机：210，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。,4.初级分离：,盐析: 4M硫酸铵，210，搅匀,静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4保存。,干扰素纯化工艺过程,溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装,1.溶解粗干扰素,配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 m滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至210。 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解： 210，匀浆，完全溶解。,2.沉淀与疏水层析,等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。 疏水层析： 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。 等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，210，静置过夜,超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。 透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。,4.阳离子交换层析与浓缩,用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。 上样，相同缓冲液冲洗。 盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱 配合SDS-PAGE收集干扰素峰。 浓缩：10 ku超滤膜进行。,5.凝胶过滤层析,洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂 上样，相同缓冲液进行洗脱。 合并干扰素部分,6.无菌过滤分装,0.22 m滤膜过滤干扰素溶液 分装 20以下的冰箱中保存。,7.检测项目,干扰素鉴别试验 干扰素效价测定 蛋白质含量，纯度测定，分子量 宿主残余蛋白、残余DNA 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列 其他：热原，内毒素，残留抗生素,演示完毕！谢谢,