实时定量PCR技术,目录,实时定量PCR基本原理 实时定量PCR的实验设计和数据处理 实时定量PCR两种相对定量方法比较 实时定量PCR实验实例分析 实时定量PCR常见故障排查 实时定量PCR的新应用,实时定量PCR基本原理,常规vs实时,优缺点比较,定量PCR三个基本概念,扩增曲线,指数增长期,平台期,线性增长期,背景期,阈值与C(t)值,阈值：是循环开始315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期 C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数,定量PCR的数学原理,理想的PCR反应： Xn=X02n 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n 方程式两边同时取对数得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n) 整理方程式得: log X0= (- log(1+Ex) )n+ log Xn 将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得： log X0= (- log(1+Ex) ) C(t)+ log Xc(t) 初始浓度的对数与循环数呈线性关系,n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,C(t)与初始模板含量,初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系,定量原理,浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量,化学原理,化学方法分类 非特异性 SYBR Green I法 特异性 TaqMan探针法,SYBR Green I法,结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度 优点 使用方便，无需复杂的设计 成本较低 缺点 与非特异性产物结合，无模板特异性 试验方法较难优化 灵敏度低,TaqMan探针法,水解型 报告基团，淬灭基团 FRET（荧光谐振能量传递） 识别特异性产物 优点 特异性高，可准确定量 灵敏度高 设计不同标记的探针，可进行多重检测 缺点 一个探针只适用于一个目标 价格较高 探针设计较繁琐,两种化学的比较,定量PCR的实验设计和数据处理,绝对定量与相对定量,绝对定量与相对定量,绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA） 相对定量：计算初始反应模板的相对含量,定量PCR-绝对定量,标准品，标准曲线 已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释 根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线 样品 与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值,使用定量PCR进行绝对定量的优势,敏感性高 检测低拷贝数样品：单拷贝 大范围拷贝数样品同时检测 1001010 省时有效,定量PCR-相对定量,相对定量的目的 比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系） 相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别 内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差,SYBR Green I法进行相对定量的问题,问题： SYBR Green I可以与非特异性双链结合 非特异产物信号 结果不准确 解决办法： 引入熔链曲线分析,熔链曲线分析,在PCR反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线,Tm值：DNA解链一半时的温度,熔链曲线分析,决定退火温度,实时定量PCR两种相对定量方法比较,相对双标准曲线法和2-c(t) 法,相对标准曲线法,用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线 处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值 用内标基因对目标基因均一化 处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异,适用范围,目标基因与内标基因扩增效率差异较大 扩增效率较低,2-c(t) 法,公式推导 M:目标基因，N：内标基因 XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域值) (1) XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值) (2) 均一化 (1)/(2): X0M/X0N=2 C(t)N- C(t)M=2-C(t) 处理2与处理1相比： (X0M2/X0N2): (X0M/X0N)= 2-C(t)2-C(t)1=2-C(t) C(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1) 当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比,一般步骤,选定目标基因和内标基因 设计一步法或两步法RT-PCR反应 数据获得及处理 目标基因C(t)值（处理，未处理） 内标基因C(t)值（处理，未处理） 计算2-c(t) 作图,适用范围,当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较一致 不做标准曲线，高通量检测,目标基因和内标基因扩增效率的快速检测,通过并列跑两条扩增曲线，查看指数增长期的曲线之间是否平行,验证试验,目的基因和内参基因扩增效率一致性检测 检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的C(t)，以稀释倍数与C(t)作图，当直线的斜率近似于0（绝对值要小于0.1）时，说明目标基因与内标基因扩增效率一致。,问题与解决,为保证扩增效率一致 扩增子长度 引物设计 模板纯度、复杂度等 反应条件,定量PCR实验实例分析,利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异（相对标准曲线法）,已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准 选用GAPDH作为内标基因 FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针 构建标准曲线 双重PCR反应 阴性对照 无RNA对照（空白） 无逆转录酶对照（基因组）,标准曲线,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,样品扩增：正常vs肿瘤,PMT1-FAM detection- ERBB2,PMT2-VIC detection- GAPDH,肿瘤,肿瘤,正常,正常,实验结果,ERBB2表达,GAPDH表达,实验结果,Healthy RNA,Tumor RNA,GAPDH,ERBB2,1095 1052,2130 2492,95500 85730,136000 130800,Copies ng/ l Total RNA,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.011,0.018,（ 2-c(t) 法）,C(t)=4.41-5.18=-0.770.18 2-c(t) =1.51-1.93 结果与双标准曲线法相近,实时定量PCR常见故障排查,故障排查-软件界面,扩增曲线 标准曲线 原始数据,扩增曲线,异常扩增曲线,扩增曲线,基线设置是否正确 基线校准 基线开始值(3-10) 基线终止值（指数期之前） 阈值设置是否正确 设置在指数增长期(可自动或手动设置）,标准曲线,原始数据,常见问题,抑制物 PCR前 精密度差 扩增曲线异常 PCR后 标准曲线差,抑制物,PCR抑制物 多糖类、有机溶剂、蛋白酶K等 样本质量 A260/A280-DNA:1.8 -RNA:2.1 RT反应中的抑制物 -RNA标准曲线,PCR抑制物,抑制物？,样本质量,起始模板量越高，抑制物含量越高,RNA标准曲线,精密度差,精密度高 精密度低,40次相同的重复 3次相同的重复,精密度低的原因,加样误差 操作、移液器、反应液未混匀 体系配置方法 低拷贝数的样品（泊松分布） 没有使用ROX校准,扩增曲线异常平台期低,样品浓度？ 引物二聚体或浓度？,扩增曲线异常指数增长期异常,无指数增长期或指数增长期较短,扩增曲线异常曲线不光滑,扩增时间开始较晚，定量不准确,标准曲线评价,评价标准曲线： 扩增效率(E) -90%-110% 相关系数(R2) -大于0.99 平行管重复性 -SD小于0.167,标准曲线差,可能的影响因素 稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解,定量PCR的新运用,等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析,谢谢！,