J. Vet. Med. B 36,321-332 (1989) 0 1989 Paul Parey Scientific Publishers, Berlin and Hamburg I S S N 093 1 - 1793 Aus dem Institut fur Veterinar-Pathologie der Freien Universitat Berlin Eine Modifikation der ABC-Methode (Avidin-Biotin-Peroxidase- Complex) fur den Nachweis von viralen Antigenen bei der Infektion der Katze durch ein Coronavirus (FIP) und der Infektion des Hundes durch das Parvovirus-Typ 2 J. WALTER, K. DOHSE und R. RUDOLPH Adresse der Autoren: Institut fur Veterinar-Pathologie der FU Berlin Mit I Abbildungen (Eingegangen am 29. November 1988) Summary A modification of the ABC-method (avidin-biotin-peroxidase complex) utilizing the proof of virale antigens of coronavirus infection of cats (FIP) and parvovirus type 2 infection of dogs A modified ABC-method (avidin-biotin-peroxidase complex) is established to demonstrate viral antigens in paraffin sections of tissues of coronavirus (FIP) infected cats and parvovirus type 2 infected dogs using monoclonal antibodies. The pros and cons and potential sources of error are described and discussed. Key words: Diagnostic immunohistochemistry, ABC-method, FIP, CPV-2 Einlei tung Die Virusdiagnostik am Paraffinschnitt eroffnet neue Moglichkeiten fur die Ermitt- lung der Atiologie und Erkennung von moglichen Erregerreservoiren. Voraussetzungen sind sensiblere Methode und zuverlassigere Lokalisierbarkeit im Vergleich zu der haufig verwendeten Immunfluoreszenz. Das Ziel unserer Untersuchung war es, einen immun- histochemischen Nachweis von Virusantigen fiir die sogenannte Parvovirose der Hunde und fur die Feline Infektiose Polyserositis (FIP) der Katzen zu etablieren. Fur dieses Vorhaben wurde die Avidin-Biotin-Technik gew5hlt. Die Griinde dafur waren, da13 diese Technik zum einen an formalinfixierten Paraffinschnitten angewandt werden kann und damit haufig auch retrospektive Untersuchungen erlaubt, die Anfertigung von dunnen Schnitten und Dauerpraparaten moglich ist, die notwendigen Reagenzien kommerziell erhdtlich sind und einen sensiblen sowie hochspezifischen Nachweis ermoglicht. Literaturiibersicht ZUT A BC-Methode Hsu und Mitarbeiter (1981 a; 1981 b) etablierten die ABC-Methode fiir den Nachweis von Hypophysen- bzw. Polypeptid-Hormonen. Das Avidin-Biotin-System wurde von GUESDON und Mitarbeitern (1 979) in die Immunhistochemie eingefiihrt. Grundlage ist die aufiergewohnlich hohe Affinitat zwischen Avidin - einem Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 68 kD, enthalten im Huhnereiweifi - und Biotin (Dissozia- U.S. Copyright Clearance Center Code Statement: 0931 - 179318913605-0321$02.50/0 322 WALTER, DOHSE und RUDOLPH tionskonstante = 10-15 L/Mol). Biotin (Vitamin H; syn.: Coenzyme R), das besonders in Leber, Niere, Pankreas und Eigelb vorkommt, hat ein Mo1.-Gew. von 244 D. Die Affinitat von Avidin zu Biotin ist etwa um den Faktor 106 hoher als die meisten Reaktionen zwischen Antikorpern und deren homologen Antigenen und fuhrt zu einer nahezu irreversiblen Verbindung (GREEN, 1975). Ein Avidinmolekul kann vier Biotinmolekule binden. Die Tatsache, dat3 die meisten Proteine mit Biotin konjugiert werden konnen, fuhrt zu der Moglichkeit, makromolekulare Komplexe zwischen Avidin und biotinilierten Enzymen, wie der Meerrettich-Peroxidase, bilden zu konnen (GUESDON u. Mitarb., 1979; HEITZMANN u. RICHARDS, 1974; Hsu u. Mitarb., 1981 a; 1981 b). Die Meerrettich- Peroxidase (HRP, horseradish peroxidase) katalysiert die Oxidation eines Elektronendo- nators in Anwesenheit ihres spezifischen Substrates HzOz. Dabei entsteht zunachst ein Primkkomplex aus HRP und H202. Die hitnoprostethische Gruppe der HRP wird oxidiert und das Peroxid zu Wasser reduziert. In einem zweiten, substratunspezifischen Schritt erfolgt die Oxidation des Donators und schliefllich die Dissoziation des Komplexes. Die Einfuhrung von 3,3-Diarninobenzidin (DAB) als idealen Elektronen-Donator - DAB wird zu einem intensiv braunen, unloslichen Polymer oxidiert (GRAHAM u. KAR- NOVSKY, 1966) - fiihrte in Folge zur Etablierung HRP-gekoppelter Antikorper zum Nachweis von Antigenen (LEWIS u. Mitarb., 1983; STERNBERGER, 1979) (s. Abb. 1). Wie bei allen hochsensitiven immunhistochemischen Verfahren gilt es auch bei der ABC-Methode, unspezifische und falsch positivehegative Ergebnisse infolge endogener und/oder exoge- ner Reaktionen zu vermeiden. Endogene Peroxidasen konnen mit dem Peroxidase-Substrat reagieren und zu falsch positiven Ergebnissen fiihren. Viele Zellen verfiigen uber Peroxidase-Aktivitaten, wie z. B. Peroxisomen der Leberzellen, Mastzellen, wei8e Blutzellen und durch das Hamoglobin auch die Erythrozyten (HEYDERMA, 1979). Diese Peroxidasen konnen durch eine Behandlung mit O,3%igem HzOZ in Methanol (STRAUS, 1971; STREEPKERK, 1972) eliminiert werden. Die exakte Einhaltung dieser Konzentration ist wichtig, da zu hohe Konzentratio- nen das Antigen zersetzen, zu niedrige die endogenen Peroxidasen nicht zerstoren. Urn unspezifische Hintergrundreaktionen - meistens verursacht du