石蜡切片的制作,石蜡切片的过程,动物的处死 动物组织取材 固定 组织固定后的处理 脱水和透明 包埋 切片,一、动物的处死,麻醉 空气栓塞 颈椎脱臼或断头 股动脉放血,二、动物组织取材,动物组织取材原则： 尽量保持组织的生活状态。 动作要快 不要过度用力夹捏组织，防止组织变形。,三、固定,1、目的： 尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变化、自溶。 保持细胞和组织原有的形态结构， 保持组织内部成分特征不发生变化。 2、方式：浸入式 灌注式,灌注式,此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取材，投入固定液。 灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。,3、固定液,醛类固定剂 非醛类固定剂 丙酮及醇类固定剂,醛类固定剂,双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。 包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛 通常与其他的试剂联合使用 优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。 缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着色，并且产生“福尔马林色素”，它是由于血红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。,非醛类固定剂,氯化汞（HgCI2）：蛋白的强固定剂 重铬酸钾：保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。 苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂， 醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。 蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。 四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与 电镜观察切片的固定与染色。,丙酮及醇类固定剂,丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以单独使用，低温下保持酶活性效果好。 乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态保存不良。,混合固定剂,固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。,4%多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4 成分： 4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中， 1倍的磷酸缓冲液:PBS MV NaCl 140mM 58.44 KCl 2.7mM 74.55 NaH2PO412H2O， 10mM 358.14 KH2PO4 1.8mM 136.09 调pH至7.4。,Bouins液,苦味酸饱和水溶液 75ml 15 固定糖原 37%-40%福尔马林液 25ml 5 固定蛋白和脂肪 冰醋酸 5ml 1 凝固核染色质,固定组织时应注意： 应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。 组织块不易过大过厚，必须小于2cm1.5cm0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。 固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。,固定时间的选择,不同的研究目的所需使用的固定液。 材料的大小，组织的特性与致密度。 温度的不同有所差别。,组织固定后的处理,冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。 修块:大小合适、去除形态不好的部分，,四、脱水,脱水目的：运用某种溶剂置换组织内的水分。 脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等,乙醇：最常用的脱水剂 一般组织：70%-80%-90%-100%- 100% 特殊组织：30%-40-%-50%-60%-70%- 80%-90%-100%- 100% 每步30分钟左右。 要求：完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间 不能过度脱水（使组织变脆） 不同组织脱水时间不同： 大的致密的组织需要延长脱水时间 为加速各级酒精的穿透力，脱水可 在37温箱中进行。,五、透明或媒浸,目的与作用 对组织的最后脱水处理 与包埋剂置换 透明剂： 苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂 100%乙醇脱水后进入二甲苯两次，保证透明完全。,六、包埋,包埋剂的特点： 具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。 能完全进入组织。 对组织内部成分损伤小。,石蜡包埋,石蜡特点：熔点：45-50 软蜡 55-60 硬蜡 常用 石蜡的处理： 新蜡应溶一次，增加密度。 并用滤纸过滤去处杂质。 加5%10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。 反复溶的旧蜡包埋效果更好。 程序：在溶蜡箱中进行55-60，恒温。 浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（1：1）中两次，在石蜡中两次，每次一个小时左右。 包块：在室温进行,七 石蜡切片,载玻片处理： 切片： 展片：背面与玻片。 烘片：37的温箱内烤干(约需12小时)。,优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄的切片，并且易于制成连续切片，也容易附着于载玻片上。 缺点：是不适于较大的标本，材料在经过脱水、浸蜡的过程中容易收缩。,火棉胶切片法,透明剂：乙醚与乙醇等量混合 包埋剂：火棉胶溶于透明剂 包埋：常温进行 凝固：在乙醚中过夜， 在氯仿中过夜。 在70%乙醇中保存。,优点：可切大的组织 可切较硬的组织如硬骨 缺点：操作所用时间长 一般切片厚度为20-30m。 不能连续切片 全部试剂为易燃物质，注意防火,冰冻切片法,取材：液氮保存 载玻片处理 切片 保存：-70 或-20,