实验1：大肠杆菌的培养和分离,微生物,单细胞原核，分支状的菌丝（基内、气生）,放线菌,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体（种群） 菌落是鉴定菌种的重要依据,菌落,芽孢：细菌的休眠体,芽孢,结构 异养型，兼性厌氧型，革兰氏阴性(红色)(G-) 物质(元素)组成：C H O N P S,大肠杆菌,按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,培养基类型,液体培养基,固体培养基,凝固剂 琼脂,扩大培养，工业生产,分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏,选择培养基 鉴定培养基,天然培养基 合成培养基,培养基成分,消毒：较为温和的方法，如酒精 注：消毒不能杀死芽孢 灭菌：强烈，所有，完全无菌 灭菌消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,无菌技术,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min（牛奶） 3、化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒（空气）,(1)常用消毒的方法：,(2)常用灭菌的方法：,1、灼烧灭菌,2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。,3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,称量-计算-溶化-灭菌-倒平板 灭菌：加上封口膜，用牛皮纸包好放在高压蒸汽灭菌锅中灭菌，1Kg压力灭菌15Min,步骤一：制备LB培养基(液),倒平板,步骤一：制备LB培养基(液),紫外灯，过滤风，酒精灯，酒精棉球 在火焰旁右手3指拿锥形瓶，2指拿封口膜 使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰 左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖 待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置,倒平板过程总结,从大肠杆菌斜面锥形瓶中的液体培养基 接种好后在37度摇床振荡培养12h 工具：接种环在接种前要灭菌,步骤二：大肠杆菌的扩大培养,分离方法：平板划线分离法 原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。 只能蘸一次、再次划线从上次末端开始、划好倒置培养1-2天、划线末端出现不连续的单个菌落,步骤三：大肠杆菌的分离纯化,平板划线接种,灼烧接种环,冷却,划线 （第一区域）,蘸取菌液,灼烧接种环,冷却,划线 （第二区域）,灼烧接种环,冷却,划线 （第三区域）,灼烧接种环,冷却,划线 （第四区域）,灼烧接种环,冷却,划线 （第五区域）,灼烧接种环,平板倒置放置培养,第一区域,第二区域,第三区域,第四区域,第五区域,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落 划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,将单菌落用划线法接种到斜面，37度培养24h后放入4度冰箱保藏,步骤四：接种到斜面保存,分离的另一种方法：稀释涂布平板法,分离的另一种方法：稀释涂布平板法,