高表达稳定细胞株的构建,实验的步骤： GDF15基因的提取及PCR扩增 载体质粒的提取(细菌的培养和质粒的提取) 双酶切 连接 转化到细菌（感受态的制备） 双酶切鉴定，基因测序鉴定 扩大培养细菌和重组质粒提取 病毒制备 转染细胞筛选稳定表达GDF15蛋白的细胞,高表达稳定细胞株的构建,Gdf15基因所在细胞的RNA的提取 反转录cDNA Gdf15基因引物设计（注意要加上酶切位点序列） PCR扩增Gdf15基因 凝胶电泳及PCR产物回收,1GDF15基因的提取及PCR扩增,利用Vector NTI 8.0软件设计NPM1基因序列扩增引物，在引物两端分别加EcoR I、BamH I酶切位点和3个保护碱基 引物名称序列 , FWDGCGGAATTCATGGAAGACTCGATGGATATGGACATG , REVGCGGGATCCTTAAAGAGATTTCCTCCACTGCCAGAG 下划线标示出限制性酶切位点,引物设计,http:/www.addgene.org/ Addgene: pLJM1-EGFP,2载体质粒的提取(细菌培养和质粒提取),举例： 1细菌： Stbl3菌株、DH5菌株,2质粒 pCDNA3.1质粒、pLJM1质粒、V51-S3质粒,甘油菌种（-80度保存）1ml 方法一： 直接取10ul至4ml培养基中，加上相应抗生素，进行培养（37度250 rpm培养12 h左右） 然后做个菌落PCR，如果有目的条带，拿去测序。当然如果以前做过测序的话，就不需要再测啦。,菌株的培养,材料： 超净工作台、酒精灯、移液枪、灭菌锅、试管、三角烧瓶、恒温摇床 试剂 LB培养基： Tryptone 10 g/L ， Yeast extract 5 g/L， NaCl 5 g/L（ph7.4-7.6） 抗生素：氨苄、卡那霉素,灭菌接种环,沾取标本,接种划线,37度培养过夜,方法二：平板划线接种法,挑取单克隆,扩大培养,材料： 灭菌锅、三角烧瓶、平板皿、超净工作台、接种环、酒精灯、恒温培养箱、移液枪、试管、恒温摇床 试剂 LB固体培养基： Tryptone 10 g/L ， Yeast extract 5 g/L， NaCl 5 g/L（ph7.4-7.6）琼脂1.5% 抗生素：氨苄、卡那霉素 注意：LB培养基121，20min高压灭菌，待冷却至50-60时，加入所需的抗生素，摇匀，倒制平板。,方法三：平板涂布法,方法一：SDS碱裂解法少量抽提质粒DNA 裂解： 取1.5 mL菌液离心(12000 rpm，1 min), 尽可能地吸干培养液。将沉淀重悬于150ul的碱裂解液I中，剧烈振荡。 加入200 ul现配的碱裂解液II，轻轻地快速颠倒混匀5次，冰浴5min。 从冰箱中取出碱裂解液III，加入150ul至EP管中颠倒混匀，冰浴5 min后离心。 加入等体积的酚和氯仿后离心，小心地吸取上清液到新的管中。 回收质粒DNA: 加入双倍体积的无水酒精，充分混匀后，冰浴3h。4度离心10 min,弃上清。 加入1 mL的70%的无水酒精清洗一次，4 C, 12000 rpm离心10 min，弃上清，将开口的EP管于室温下使酒精挥发，约10 min左右。用50 ul的RNA酶（40 uL/mL)的ddH2O重新溶解核酸，温和的振荡几秒，-20度保存备用。 琼脂糖凝胶电泳：,质粒的提取：,材料： 离心机、移液枪、冰盒、EP管等 试剂 碱裂解液： 50nmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。 碱裂解液： 0.2N NaOH（从10N贮存液中现用现稀释）；1%（m/V）SDS碱裂解液要现用现配制，室温下使用。 碱裂解液： 5mol/L乙酸钾 60ml；冰乙酸11.5ml；H2O 28.5ml，保存在4 C。,方法二、质粒小抽试剂盒（天根、Axgen） 简单快速方便、价格也便宜,EcoR I 和BamH I 双酶切 用限制性内切酶EcoR I 和BamH I 双酶切载体V51-S3和NPM1基因片段，37 C，4 h。 酶切产物回收（胶回收试剂盒）,4连接构建重组质粒,3双酶切,将NPM1基因双酶切片段与线性化载体V51-S3连接重组，16水浴连接过夜。,1）取10 L连接产物加入到100 l E.coli DH5感受态中，轻轻吹打混匀，冰上放置30 min； 2） 42热激90 s，冰浴5 min； 3） 加入1 mL 37预热的LB液体培养基，37，250 rpm摇菌复苏1 h； 4） 3000 rpm离心2 min，吸去上清，剩余100 L 菌液用移液枪吹打重悬菌体，涂布于LB/氨苄青霉素（100g/ml）平板上（涂平板），37正置培养30 min，然后倒置培养12 h左右； 5） 挑转化后的若干个单克隆菌落接种到4 mL LB/氨苄青霉素（100 g/ml）液体培养基中，37，250 rpm培养12 h左右，用于提取质粒。,5转化（将连接的重组质粒转化进入到细菌中）,1） 挑E.coli DH5单克隆菌落接种到4mL LB液体培养基中，37，250 rpm摇菌12-14 h； 2） 接种2 mL培养的菌液到含有100 mL LB液体培养基培养瓶中，37，250 rpm摇菌至OD600为0.3-0.5； 3） 将菌液倒入50 mL灭菌离心管中，冰浴20 min后，4，3000 rpm离心10 min； 4） 吸去上清，用20 mL冰冷的50 mM CaCl2溶液轻轻重悬菌体，冰浴30 min； 5） 4，3000 rpm离心10 min，吸去上清，用4 mL冰冷的CaCl2溶液（3.25 ml 50 mM CaCl2溶液和0.75 mL 80%甘油混合）轻轻重悬菌体，即为感受态细胞； 6） 每管100 L分装于1.5 mL离心管中，-80保存备用。,感受态制备,6双酶切鉴定,基因测序鉴定,7扩大培养细菌和重组质粒提取,碱裂解法大量抽提质粒（200+ml 菌液）,1) 细胞转染前将293T细胞以1.5106的密度培养于10 cm细胞培养皿中培养24 h，保证转染时细胞汇合度达到50%-60%。 2) 转染前3 h将待转染细胞培养基换为无血清MEM培养基。 3) 取16 g质粒（7.5g pLKO.1；2.9 g PCMV-VSVG；5.6 g PCMV-dR8.2）至0.5 ml无血清MEM培养基中，轻轻吹打混合均匀。再取15L Lipofectamine 2000至0.5 mL无血清MEM培养基中，轻轻吹打混合均匀，室温孵育5 min。混合两份培养基（总体积1.0mL）轻轻吹打混合均匀，室温孵育25 min。 4) 在待转染细胞中加入4 ml无血清培养基，逐滴加入步骤3的混合液。轻轻晃动培养皿使溶液混均，放至37，CO2培养箱中培养6 h后换成10%血清的DMEM培养基培养。 5) 48 h后收集病毒，取上清培养基至15 mL离心管中，2000 rpm，4离心7 min收集上清，4保存，如需长期保存存于-80。,8病毒制备,将细胞接种于6孔板内，每孔加入1.5mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，将500ul病毒分别加到细胞悬液中，侵染48h后，加入1 ug/mL puromycin嘌呤霉素进行筛选得到稳定表达GDF蛋白的细胞株和转染空载质粒的对照稳定株。 分别收集细胞，裂解提取总蛋白，用于Western Blot鉴定。,9转染细胞筛选稳定表达GDF15蛋白的细胞,