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1 / 7 PCR 产物的 TA 克隆 (DNA的胶回收和连接) 【实验原理】 1.DNA片段回收方法:DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中,通上一定电压进行电泳, 不同大小的DNA 分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA 片段的凝胶,用冻 融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。 2.利用 Taq 酶能够在PCR 产物的 3末端加上一个非模板依赖的A,而 T 载体是一种带 有 3T 突出端的载体, 在连接酶作用下,可以把 PCR 产物插入到质粒载体的多克隆位点, 可用于 PCR 产物的克隆和测序。 商品化的T 载体有很多。本实验采用TaKaRa 公司的 pMDTM18-T Simple Vector 。这 个载体以pUC19 载体为基础, 消除了 pUC18载体上的多克隆酶切位点,经 EcoR 酶切后 在两侧的 3端添上“ T”制备而成(见附录1) 。由于本载体上消除了多克隆酶切位点,克 隆后的 PCR 产物将无法使用载体上的限制酶切下,需要在 PCR 扩增引物上导入合适的酶切 位点。 【试剂与器材】 (一)试剂 1.pMDTM18-T Simple Vector Kit(Takara 公司) 。 2.TAE 电泳缓冲液 3.琼脂糖( Agarose ) 4.6 电泳加样缓冲液:0.25 溴粉蓝, 40(w/v) 蔗糖水溶液,贮存于4。 2 / 7 5.溴化乙锭 (EB)溶液母液:配制成10mg/mL,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。 6.70% 乙醇 7.胶回收试剂盒(Omega公司) (二)器材 水平式电泳装置,电泳仪 ,台式高速离心机, 恒温水浴锅 , 微量移液枪 , 微波炉或电炉,紫外透 射仪 , 凝胶成像系统或其它照相设备。 【操作方法】 (一)胶回收试剂盒回收PCR 产物(以Omega公司Gel Extraction Kit为例) 1.当目的片段DNA 完全分离时,转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。 2.凝胶块转移至1.5ml离心管 (离心管已经称重了)中,称重得出凝胶块的重量。近似地确定 其体积(假设其密度为1g/ml ) 。加入等体积的Binding Buffer (XP2) ,于 55-65 水浴 中温浴 7min或至凝胶完全融化,每2-3 min振荡混合物。 (在凝胶完全溶解之后,注意凝 胶-Binding buffer混和物的pH 值。如果其pH 值大于 8 的话, DNA 的产量将大大减少。 如果是橙色或红色,则要加入5 l 浓度为 5 M ,pH 为 5.2 的醋酸钠,以调低其pH 值。该 混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。) 3.取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干凈的2ml 收集管内(已备好) 。 4.将第三步获得的DNA/ 熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000 x g 离心 1 分钟。弃收 集管中的滤液,将柱子套回2ml 收集管内收集管。 5.如果 DNA/ 凝胶熔液的体积超过700ul ,一次只能转移700ul至柱子中, 余下的可继续重 3 / 7 复第 5 步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibind DNA 回收纯化柱都有一个极限为25 g DNA的吸附能力。如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱子中。 6.弃收集管中的滤液, 将柱子套回2ml 收集管内收集管。 转移 300 l Binding Buffer(XP2 ) 至柱子中,室温下,10,000 x g下离心 1min 。 7.弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml 收集管内收集管。 转移 700 l SPW Wash buffer( 已 用无水乙醇稀释的)至柱子中。室温下10,000 xg离心 1min 。 (浓缩的SPW Wash Buffer 在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果 DNA 洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中 的,须将其拿出置于室温下)。 8.重复用 700 l SPW Wash buffer洗涤柱子。室温下10,000 xg离心 1min 。 9.弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml 收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心 2 min以 甩干柱子基质残余的液体。 10. 把柱子装在一个干凈的1.5ml 离心管上,加入 1530 l (具体取决于预期的终产物浓度) 的 Elution Buffer(或 TE 缓冲液 )到柱基质上,室温放置1min, 13,000 xg离心 1min 以洗脱 DNA 。第一次洗脱可以洗出70-80% 的结合DNA 。 如果再洗脱一次的话,可以把残余的 DNA 洗脱出来,不过那样的浓度就会较低。 (二)连接反应(以Takara 公司 pMDTM18-T Simple Vector Kit为例) 1)在微量离心管中配制下列DNA 溶液,全量为5 l。 pMDTM18-T Simple Vector 1 l Insert DNA 0.1 pmol0.3 pmol dH2O up to 5 l 4 / 7 2)加入 5 l(等量)的Solution I。 3)16反应 30 分钟。 (2 kbp 以上长片段PCR 产物进行DNA 克隆时,连接反应时间请 延长至数小时) 。 4)全量( 10 l)加入至100 l 感受态细胞中,冰中放置30 分钟。 5)42加热 45 秒钟后,再在冰中放置1 分钟。 6)加入 890 l LB 培养基, 37 振荡培养60 分钟。 7)在含有 X-Gal 、IPTG、Amp 的 LB 琼脂平板培养基上培养,形成单菌落。计数白色、蓝 色菌落。 8)挑选白色菌落,鉴定载体中插入片段的长度大小。 【注意事项与提示】 1.使用新鲜的电泳缓冲液TAE Buffer 。不要重复使用,其PH 的升高会减少产量。 2.不论采取何种方法回收DNA ,在回收过程中,要尽量减少洗脱体积,以便提高收得率和 浓度,以方便后续操作。 3.从胶上回收DNA 时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm),以减少紫 外光对 DNA 的切割。 DNA 曝露在紫外灯下不能超过30 秒。 4.连接反应时间是与温度密切相关,因为反应速度随温度的提高而加快。通常可采用16 连接4 小时为宜,如是平端连接需要适当延长反应时间以提高连接效率;在选择反应的温 度与时间关系时,也要考虑在反应系统中其他因素的影响。 5.连接反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染,为防止酶活性降低,取酶 时应在冰上操作且动作迅速。7. 5 / 7 6.连接反应应在25 以下进行, 温度升高较难形成环状DNA ,影响连接效率。 长片段 PCR 产物( 2kb 以上)进行连接时,连接反应时间应延长至数小时。 7.进行克隆时, Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比一般为1:210 。根据实验情况选 择合适的摩尔数比。 8.用高效的感受态细胞(转化效率1108 cfu/ g pUC19 ) ,这样才可能得到比较理想的 阳性克隆。 9.试剂盒配有Control DNA。通过对照实验判断试剂盒的保存效果。 【实验安排】 第一天下午:配制6电泳加样缓冲液、TAE 等缓冲液,将各种耗材灭菌。 第二天上午:制备琼脂糖凝(1% ) ,电泳检测,切胶回收DNA 片段 第二天下午:大肠杆菌制备感受态细胞;DNA 与 T 载体连接转化大肠杆菌。 第三天上午:观察转化结果(蓝白斑情况),计算重组率。 【实验报告要求与思考题】 1PCR 产物的 T-vector克隆方法,应注意哪些操作环节? 6 / 7 2和其他组结果比较,对本组实验结果进行分析。 3对于用高保真Taq DNA聚合酶扩增的PCR 产物,如何进行克隆? 附录 1: 附录 2: 7 / 7
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