实验二 细菌的简单染色与革兰氏染色,一、目的要求,1、巩固显微镜的使用方法； 2、掌握细菌的简单染色和革兰氏染色的原 理和方法。,二、基本原理,革 兰 氏 染 色,用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。 碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美兰、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。 酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。 中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美兰、伊红天青等。,简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。,革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较,成分 占细胞壁干重的% 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 肽聚糖 含量很高（50-90） 含量很低（10） 磷壁酸 含量较高（50） 无 类脂质 一般无（ 2） 含量较高（20） 蛋白质 无 含量较高,G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经沙黄复染后就成红色。 G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。,三、实验器材,1、材料 培养12-16h的枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli） 2、染色液和试剂 草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、沙黄、二甲苯、香柏油 3、器材 废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。,四、实验方法及步骤,1、简单染色 （1）涂片 取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂枯草杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的枯草杆菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。,（2）晾干 让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文 火烘干。 （3）固定 手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3 次固定（以不烫手为宜）。 （4）染色 将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上， 加沙黄染色1-2min。 （5）水洗 用水洗去涂片上的染色液。 （6）干燥 将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸 吸干。 （7）镜检 先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的 视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏 油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观 察细菌的形态。,涂片,干燥,固定,染色,水洗,镜检,简单染色方法,干燥,2、革兰氏染色,（1）涂片 与简单染色涂片相同； （2）晾干 与简单染色法相同； （3）固定 与简单染色法相同； （4）初染 将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min； （5）水洗 倾去染色液，用水小心地冲洗；,（6）媒染 滴加碘液，媒染1min； （7）水洗 用水洗去碘液； （8）脱色 将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2 0-25s至流出液无色，立即水洗； （9）复染 滴加沙黄复染5min； （10）水洗 用水洗去涂片上的沙黄染色液； （11）晾干 将染好的涂片放空气中晾干或者用吸 水纸吸干； （12）镜检 镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油 镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应 性。,五 注意事项,1、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定，需要多加练习； 2、选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,六 思考题及作业题,1、当对未知菌进行革兰氏染色时，如何保证操作正确及结果可靠？ 2、简述革兰氏染色的原理和步骤。,球菌,杆菌,大肠杆菌,革兰氏阴性菌,革兰氏阳性菌,