第三章 基因工程制药,概述 一、基本概念 DNA重组 （in vitro DNA recombination technology ）： 基因克隆（gene cloning） 或分子克隆（molecular cloning）技术。 基因工程（gene engineering） ：,二、基因工程产生的基础 1 理论上三大发现 40年代发现了生物的遗传物质-DNA 50年代阐明了生物遗传物质的分子机制，Watson and Crick提出了DNA双螺旋结构模型。 60年代确定了遗传信息的传递方式-中心法则,一、重组DNA技术的基本过程 基因工程要素 目的基因的制备和分离 DNA重组体的构建 DNA重组体扩增和表达 重组体筛选和鉴定 外源基因的表达 表达产物的分离纯化、鉴定,二、基因工程的分类 真核基因工程 原核基因工程,三、重组DNA技术-基因工程与医学的关系 1.研究基因的结构功能和活动的规律。 2.为疾病的防治、诊断、预后及发病机理的研究开辟新途径。 3.研究细胞分化和胚胎发育的本质问题。 4.基因治疗。 5.促进基础理论的研究。,四、基因工程技术制备药物的优势 制备很珍贵但利用传统方法难以制备的药 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入研究， 可以发现和挖掘更多的内源生理活性物质。 内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白工程进行改造和克服。 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。,第三节 基因工程的酶和载体 第一部分：工具酶 限制性内切酶和甲基化酶 DNA连接酶 DNA多聚酶 第二部分：基因工程的载体 原核细胞（大肠杆菌）的常用载体： 真核细胞载体：,第一部分：工具酶 一 限制性内切酶和甲基化酶 限制性内切酶的发现 限制性内切酶的生理功能 限制性内切酶的分类和命名 识别和切割位点及切割片段的末端 型酶的分类 反应系统 限制性内切酶的应用,1限制性内切酶（restriction endonuclease) 定义 发现 Arber的假说 限制修饰酶,2 限制性内切酶的生理功能 构成了细胞抵御外源入侵DNA的防御机制 提供了细菌种属间进行交叉繁殖的屏障，但又允许外源DNA有某些遗漏,3 限制性内切酶的分类和命名 三种类型：型、型、型 命名：EcoR E: Escherichia 属 Co:coli 种 R: RY13株 ：该菌株第一个被发现的核酸内切酶,4 型限制性核酸内切酶： 识别与切割DNA链上同一个特异性核苷酸顺序，产生特异性的DNA片断。 1）基本特性 识别与切割DNA链上同一个特异性核苷酸顺序 切割片段的末端 对dsDNA的两条链同时切割，产生3种不同的切口：,识别序列：,切割末端：,5GTTAAG-3,3CAATTG-5,5GTT-3,3CAA-5,5AAG-3,3-TTG-5,平末端,5CTGCAG-3,3GACGTC-5,5CTGCA-3,3-G,5G-3,3ACGTC-5,5-粘末端,Hpa I,Pst I,5GAATCC-3,3CTTAAG-5,5-G-3,3CTTAA-5,5AATCC-3,3G-5,EcoR I,3粘末端,5 型酶的分类 A:Isochizomers(异源同工酶)，来源不同，识别顺序相同的酶。 Sma Xma 它们识别顺序相同，切割位点不同，产生平头或粘性末端。,C C C G G G G G G C C C,C C C G G G G G G C C C,B:,同尾酶（isocaudarner）,来源及识别序列不相同，切割后产生相同的粘性片段,6 反应系统 组成：酶及活性缓冲液（buffer)： 影响酶反应的因素： DNA的纯度 DNA甲基化程度 DNA分子结构：线性环状 反应温度 反应系统组成,7 限制性内切酶的应用 DNA重组 组建新质粒 组建DNA物理图谱 DNA的分子杂交 制备DNA的放射性探针 DNA的序列分析 DNA甲基化碱基的识别与切割。,二、DNA连接酶 功能:是指催化两条分别具有5-磷酰基末端与3-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶 常用的连接酶： T4 DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶,1 T4 DNA ligase 来自T4感染的Ecoli，MR:68Kd，辅助因子：Mg2+ and ATP 1）反应特性 5ACG-OH P-AATTCGT-3 TGCTTAA-P + OH-GCA-5 ATP Mg2+ 5ACGAATTCGT3 3TGCAAGTTCA5,2）20ul 反应体系: 10*buffer 2ul(66 mM Tris-HCl, pH7.5, 6.6 mM MgCl2, 10 mM MDTT,0.4 mM ATP) 底物 10pM 连接酶： 0.01-0.1unit 3）反应温度及时间： 16，过夜 4）用途：粘端DNA或切口间连接，也连接平末端,2大肠杆菌DNA连接酶 来自Ecoli, Mr:7.4kDa, 辅助因子NAD+。 作用：封闭双螺旋DNA上具有5磷酸酰基和3羟基的缺口（nick）形成磷酸二酯键。无法封闭裂口（gap）。因此可连接粘性末端的DNA片断，不能连接平末端的DNA片断。 用途：粘端DNA或切口间连接,三 DNA多聚酶 聚合酶 Taq DNA聚合酶 逆转录酶(reverse transcriptase) 末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidayl Transferase）,(一）聚合酶 功能：以DNA or RNA为模板，催化DNA and RNA的体外合成。 以DNA为模板 不耐热聚合酶 耐热聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 Klenow大片段酶 pfu聚合酶 T4(T7)噬菌体DNA聚合酶 以RNA为模板 反转录酶,共 性： 需要引物和模板 不能起始新的DNA连，催化dNTP连续加到双链DNA分子引物链3OH端； 不发生从引物模板上解离,1 大肠杆菌DNA聚合酶（E.coli Polymerase） 来自E.coli细胞。Mr:109kD。 由单一多肽组成。沿DNA模板催化核苷酸聚合，是一多功能酶，有三种活性：,5-3 外切酶,N,3-5 外切酶,聚合 酶,C,小片段,大片段（Klenow片段）,1）53聚合酶活性 在模版指导下，以4种dNTP为底物，催化单核苷酸接合到DNA引物的3-OH末端。 5CCGOH 5CCGATAGCCT GGCTATCGGA GGCTATCGGA 催化合成的要求：模板，4种dNTP，引物，引物与模板形 成正确的氢键配对,三种活性： gap filling:在双链DNA上的缺口部分的3OH末端上附加核苷酸，补平其链部分 Nick translation:在双链DNA的切口部分的3OH末端附加核苷酸，同时外切性除去5末端的核苷酸。 Strand displacement:通过在切口的3OH末端附加核苷酸达到置换据有5-末端的链,2） 双链特异性的53外切酶活性 无dNTP时，从5末端降解ds-DNA成为5单核苷酸。,5CGCATCG GCGTAATC,5CATTAG 3GCGTAAGC,PC 、PG,3）单链特异性的3-5外切酶活性 无dNTP时从3-OH末端降解ss-DNA或游离3_OH末端成为单核苷酸。,5CGCATCG,GCG,5CGC,GCG,PA、PC、PT、PG,5-3外切酶 3-5外切酶 起始端 5-P 3-OH 断裂位置 末端磷酸二酯键 3OH末端 切除特点 配对的 不配对的 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸,coli DNA Pol在基因工程中的用途： 制备高比活的DNA探针 用于分子克隆 DNA序列分析 与DNaseI一起使用，进行切口平移 通过Okayama_Berg合成cDNA的第二条链,Klenow 片段： E.coli DNA 聚合酶的一个大片断。MW:7.6KDa。 具有聚合酶I的53聚合酶活性 在模版和引物存在时，以dNTP做底物，沿5-3方向合成与模版互补的DNA。 对单链DNA有3 5外切酶活性，较弱，不适于3突出端的平滑化 无53外切酶活性。,Klenow 片断用途： 填充用限制酶消化dsDNA的3延伸末端平末端。 用32PdNTP进行补平反应，可对DNA 3末端进行标记 合成cDNA第二条链。 寡核苷酸定向诱变中双链DNA合成 在Sanger ddNTP系统中进行顺序分析。,（二） Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。MW:6.5kDa. 在模版及引物存在的条件下，催化与模版互补的脱氧核苷酸一次选择性地连接在引物的3OH末端上的反应 末端A, 即粘性末端 53外切核酸酶活性 有链置换的能力。 无3 5 外切核酸酶活性，无校对功能,易突变。 Mg2+依赖酶,用途： DNA序列分析； 应用于聚合酶连反应（PCR）,对DNA分子的特定序列体外扩增(产物为粘末端）；,pfu DNA Polymerase 有DNA聚合酶活性 没有逆转录活性 有3-5方向的外切酶活性. 产物为平末端 但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。 常用于PCR反应 高保真,（三）、逆转录酶(reverse transcriptase) 1 特性： 依赖于RNA的DNA聚合酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶 有效的转录RNA成为DNA 产物DNA又称cDNA,即互补DNA(Complementary DNA) 逆转录酶是一个多功能酶,2 活性： 将真核生物的mRNA转录成cDNA。 单链DNA或RNA为模板时，使用反转录酶制备杂交探针。 标记带5突出端的DNA片断。 用于双脱氧链法测序 反转录PCR。,（四）末端脱氧核苷酸转移酶 （Terminal Deoxynucleotidayl Transferase） 简称末端转移酶（Terminal Transferase） 来自小牛胸腺，Mr:34kD,碱性蛋白质。 作用： 在二价阳离子存在下，催化dNTP沿5-3方向聚合作用逐个顺序加于线性DNA分子的3OH末端。 不需模版，4种dNTP任意一种可作前体物；只一种dNTP组成有一种核苷酸组成的3尾巴，同聚物尾巴,用途： 给载体或cDNA加上同聚尾。 3末端用32P标记的dNTP标记。 利用非放射性标记物生物素-11-dUTP渗入到DNA片段分子的3末端。,第二部分：基因工程的载体 一、概述 载体的概念（Vector）：凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因并具有传递运载外源DNA导入宿主细胞能力的DNA片段称为载体。,载体的功能及特征,运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记 具有较高的外源DNA的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,用于基因工程的载体,质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 人造染色体载体,质粒(plasmid),质粒的基本特征 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子. 质粒常见于原核细菌和真菌中 绝大多数的质粒是DNA型的 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA( covalenty, closed and circular double-stranded DNA) 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb,质粒DNA分子构型： 三种分子构型： 线性(sscDNA)：L-构型 环状（OCDNA)：一条保持完整环形结构，另一条链有缺口，OCD构型 超螺旋