1 DNA 的粗提取与鉴定DNA 的粗提取与鉴定 考点梳理考点梳理 考点一、DNA 粗提取的原理考点一、DNA 粗提取的原理 1、DNA 在 NaCl 溶液中的溶解性 说明：DNA 和蛋白质等成分在不同 NaCl 溶液浓度中溶解度不同，通过控制 NaCl 溶液浓度达到分离目的。 画出 DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中的溶解度曲线，并根据曲线图思考 在什么浓度下，DNA 的溶解度最小？DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度是如何变化的？ 如何通过控制 NaCl 溶液的浓度使 DNA 在盐溶液中溶解或析出？ 2、DNA 不溶于酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将 DNA 进一步“提纯” 。 3、DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解 ，但是对 没有影响。大多数蛋白质不能忍受 6080oC 的高温， 而 DNA 在 以上才会变性。洗涤剂能够瓦解 ，但对 DNA 没有影响。 考点二、DNA 粗提取与鉴定实验过程考点二、DNA 粗提取与鉴定实验过程 1、实验材料的选取 请从下面的材料中选取适合的（花菜、鸡血、猪血、洋葱） 取材的原则是：一是组织材料中含较多的 ；二是取材时，要注意保护环境，不要将 的生物作为实验材料。 本实验为什么不能选用猪血细胞作为实验材料？ 2、破碎细胞，获取含 DNA 的滤液 如果本实验选取的实验材料是鸡血和洋葱，在破碎细胞获取含 DNA 的滤液时，所采用的方法有什么不同？ 鸡血： 洋葱： 为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 提示：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅 拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出 DNA。 加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 提示 ： 洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于 DNA 的释放 ； 食盐的主要成分是 NaCl，有利于 DNA 的溶解。 如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响? 提示：研磨不充分会使细胞核内的 DNA 释放不完全，提取的 DNA 量变少，影响实验结果，导致看不到丝状 沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 提示：可能含有核蛋白、多糖和 RNA 等杂质。 3、去除滤液中的杂质 说出下列三种方案的“去杂”原理 再次使用不同浓度的 NaCl 溶液，分别使用 2mol/L 0.14mol/L 该溶液， “去杂”的对象分别是什么？ 在滤液中加入“嫩肉粉” （含木瓜蛋白酶） ，让其反应 15 分钟。 将滤液放在 60-75的恒温水浴箱中保温 15 分钟。 4、DNA 的析出与鉴定 2 要使滤液中的 DNA 析出， 需要加入一种特殊的溶液， 加入后还需静置 2-3 分钟。 这种特殊的溶液是什么？ 静置的目的是什么？此时，溶液中会看到什么现象？怎样用玻璃棒卷起？被卷起的“丝状物”是一个 DNA 分子吗？ 如何对提取的 DNA 进行鉴定？（想一想：细胞中 DNA 如何鉴定？） 考点三、PCR 技术（体外 DNA 分子扩增）考点三、PCR 技术（体外 DNA 分子扩增） 以下为体外扩增仪中 PCR 过程示意图 说明：第一轮的产物作为第二轮的模板再经历上述说明：第一轮的产物作为第二轮的模板再经历上述三个步骤，如此循环。三个步骤，如此循环。 1、变性：当温度上升到 以上时，双链 DNA 解旋为单链。 （想一想：在细胞内 DNA 复制时，是怎样 完成这一步骤的？） 2、复性（退火）：当温度下降到 左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合。 （想一 想：在细胞内这一过程需要引物作用吗？） 3、延伸：当温度再次上升到 时，溶液中的四种 在 酶的作用下，根据碱 基互补配对原则合成新的 DNA 链。 （想一想：与细胞内相比，该酶作用有什么特点？它是怎样工作的？） 强调：引物是指能够与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对的一小段 DNA 或 RNA，PCR 技术只能特异地复制 处于两个引物之间的 DNA 序列，使这段固定长度的序列呈指数增长。 强调：引物是指能够与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对的一小段 DNA 或 RNA，PCR 技术只能特异地复制 处于两个引物之间的 DNA 序列，使这段固定长度的序列呈指数增长。 作为引物对，在设计时要关注哪些要素？作为引物对，在设计时要关注哪些要素？ 4、PCR 技术和 DNA 复制的比较（寻找共同点和不同点） DNA 复制PCR 技术 场所 原理 酶 条件 原料 特点 典题赏析典题赏析 例 1、某同学在做 PCR 反应实验时，最关键的是需要控制（ ） A、氧气的浓度 B、酸碱度 C、温度 D、大气的湿度 例 2、 （2011 江苏卷）在利用鸡血进行“DNA 的粗提取与鉴定”的实验中， 相关叙述正确的是（ ） A用蒸馏水将 NaCl 溶液浓度调至 0.14mol/L，滤去析出物 B调节 NaCl 溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质 C将丝状物溶解在 2mol/NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色 D用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同 例 3、多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术。请回答下列有关 PCR 技术的基本原理 3 及应用问题。 （1）DNA 的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为 5/端，当 与 DNA 母链通过碱基互补 配对结合后，DNA 聚合酶就能从引物的 开始延伸 DNA 链。 （2）PCR 利用了 DNA 的热变性原理解决了打开 DNA 双链的问题，但又导致了 DNA 聚合酶失活的新问题。 到 20 世纪 80 年代，科学家从一种 Taq 细菌中分离到 ，它的发现和应用解决了上述问题； 要将 Taq 细菌从其它普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫 。 （3）PCR 的每次循环可以分为 三步。 假设在 PCR 反应中，只有一个 DNA 片段作为模板， 请计算在 5 次循环后，反应物中大约有 个这样 的 DNA 片段。 *（4）图中引物为单链 DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。 从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物 A 的 DNA 片段所占的比例为 。 在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的 DNA 片段。 （5） 设计引物是 PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理 （如 下图） ，请分别说明理由。 第 1 组： ；第二组 。 （6）PCR 反应体系中含有热稳定 DNA 聚合酶，下面的表达式不能正确反映 DNA 聚合酶的功能，这是因 为 。 （7）目前 PCR 技术的主要应用在 等方面。 （1）磷酸基团 3/端 （2）耐高温的 TaqDNA 聚合酶；选择培养基 （3）变性、退火、延伸；32 （4） 15/16 ； 三 （5）引物和引物局部发生碱基互补配对而失效引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失 效 （6）DNA 聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链 DNA 片段的引物链上 （7）遗传疾病的诊断、 刑侦破案、古生物学、基因克隆和 DNA 序列测定 例 4、某生物兴趣小组开展 DNA 粗提取的相关探究活动。具体步骤如下： 材料处理 ： 称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各 2 份每份 l0 g。剪碎后分成两组，一组置于 20、另一组置 于一 20条件下保存 24 h。 DNA 粗提取： 第一步：将上述材料分别放人研钵中，各加入 l5 mL 研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤 取滤液备用。 第二步：先向 6 只小烧杯中分别注人 10mL 滤液，再加人 20 mL 体积分数为 95的冷酒精 溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。 第三步：取 6 支试管，分别加入等量的 2 molL NaCl 溶液溶解上述絮状物。 DNA 检测 ： 在上述试管中各加入 4 mL 二苯胺试剂。混合均匀后，置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后比较 溶 液的颜色深浅,结果如下表。 4 分析上述实验过程，回答下列问题： (1)该探究性实验课题名称是 。 (2)第二步中”缓缓地”搅拌，这是为了减少 。 (3)根据实验结果，得出结论并分析。 结论 1：与 20相比，相同实验材料在-20条件下保存，DNA 的提取量较多。 结论 2： 。 针对结论 I请提出合理的解释： 。 (4)氯仿密度大于水， 能使蛋白质变性沉淀， 与水和 DNA 均不相溶， 且对 DNA 影响极小。 为了进一步提高 DNA 纯度，依据氯仿的特性在 DNA 粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是： 。然 后用体积分数为 95的冷酒精溶液使 DNA 析出。 【答案】 】 （1）探究不同材料和不同保存温度对 DNA 提取量的影响 （2）DNA 断裂 （3）等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的 DNA 量最多 低温抑制了向光酶的活性，DNA 降解速度慢 （4）将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液 【解析】 】本题考查了 DNA 粗提取技术的原理、操作过程及同学分析、判断能力，从题目实验看出，该 实验的课题是探究不同材料和不同保存温度对 DNA 提取量的影响。在试用第二步中，为了防止 DNA 断裂， 要缓缓的搅拌， 从表中结果看出， 由于低温抑制了相关酶的活性， DNA 降解慢， 使得相同材料在低温保存下，DNA 提取量大，在相同条件先，蒜黄蓝色最深，说明相同条件下从蒜黄中提取的DNA量最大，由于氯仿密度比 水大，可使蛋白质变性后沉淀，而与水、DNA 不相溶，这样可将第三步获得的溶液与等量的氯仿混合， 静置 一段时间，吸取上清液即可得到较纯净的 DNA。 巩固练习巩固练习 1、DNA 粗提取实验中有三次过滤：过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液过滤含粘稠物的 0.14mol/LNaCl 溶液过滤溶解有 DNA 的 2mol/LNaCl 溶液，以上三次过滤分别为了获得（ ） A 含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含 DNA 的滤液 B 含核物质的滤液、滤液中 DNA 粘稠物、含 DNA 的滤液 C 含核物质的滤液、滤液中 DNA 粘稠物、纱布上的 DNA D 含较纯的 DNA 滤液、纱布上的粘稠物、含 DNA 的滤液 2、在 DNA 提取过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是（ ） A.不易破碎 B.减少提取过程中 DNA 的损失 C.增加 DNA 的含量 D.容易洗刷 3、下列操作中，对 DNA 的提取量影响最小的是（ ） A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出 DNA 等核物质 B.搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌 C.在“析出 DNA 粘稠物”时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增加 D.在用酒精沉淀 DNA 时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却 4、在向溶解 DNA 的 NaCl 溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（ ） A.加快溶解 DNA 的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少 DNA 的溶解度，加快 DNA 析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出 5 5、下列有关“利用菜花进行 DNA 的粗提取与鉴定”实验的叙述中，正确的是（ ） A采用不同浓度的 NaCl 溶液反复溶解与析出 DNA 的方法可去除部分蛋白质等杂质 B在切碎的菜花中加入一定量的蒸馏水，充分研磨后过滤获取滤液 C用蒸馏水将 NaCl 溶液浓度调至