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AKTA蛋白纯化系统操作AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备,自动化程度很高。AKTA系统依据不同的配置,可以分为AKTA EXPLORER、AKTA PILOT、AKTA PURIFIER等多种型号的设备。以下以AKTA EXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。1、认识AKTA。 AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件,在底部平台的左侧整齐堆起(Fig 1)。它们是:FIG 1、AKTA EXPLORER主机 Pump-900 为双通道高效梯度泵系列。在AKTAexplorer 100,流速范围0.01-100 ml/min,压力高达10 Mpa(泵名为P-901)。在AKTA explore10,流速范围0.001-10 ml/min,压力高达25 Mpa(泵名为P-903)。 Monitor UV-900,同时监控190700 nm 范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见(UV-Vis)监测器。(针对部分AKTA PURIFIER机型,尚有UPC-900监测器可供选择,光源为汞灯光源,一次可以监控一个波长,安装滤光片后,可以在选择的波长范围内进行切换。) Monitor pH/C-900,在线电导和pH 监测的组合监测器。Fig 2、AKTA EXPLORER硬件模式图AKTA EXPLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示(Fig 2)。组成部件,如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。分离装置由UNICORN 软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中,在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。2、一般操作2.1 开机按位于底部平台前左侧的ON/OFF 按钮,打开色谱系统,然后打开电脑电源。待仪器自检完毕(CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁)。双击桌面上UNICORN图标,进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口(Fig 3)Fig 3、Unicorn的操作界面2.2 准备工作溶液和样品所有的工作溶液和样品必须经过0.45m的滤膜过滤,样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂(如乙腈、甲醇),需在使用前用低频超声脱气10min。2.3 清洗及管道准备首先将A泵的进液管道(A1)放入缓冲液或平衡液中,将B泵的进液管道(B1)放入高盐溶液中,在system control窗口点击工具栏内的manual,选择 pumppump wash explorer,选中A1,B1管道为ON, execute。泵清洗将自动结束。(Fig 4)Fig 4、AKTA Explorer的泵清洗操作2.4安装层析柱在manual里选择pumpflow rate,输入一定的低流速(Fig 5),insert;选择Alarm&monalarm pressure,设置high alarm(输入填料或层析柱的耐受压力,以较低者为设置值,具体可在填料说明书或层析柱说明书中查到),insert,execute(Fig 6) 。待InjectionValve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头,稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。Fig 5、AKTA Explorer的流速设定操作Fig 6、AKTA Explorer的限压设定操作2.5 开始纯化:1)在柱子平衡好之后(电导,pH的数值和变化趋势稳定)即开始上样了。此时应将紫外调零(Fig 7),选择Alarm&monautozero,exectue。Fig 7、AKTA Explorer的紫外调零操作2)具体上样方式:AKTA系统的上样方式比较灵活,可以根据具体样品的条件进行上样,包括用样品环上样、用系统泵上样、用样品泵上样等,这里以用系统泵上样为例简单介绍上样过程。点击pause,将A1放入样品中,点击countine,待样品上完后,再将A1放入到平衡液中继续清洗柱子。3)洗脱:上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。在manual里选择pumpgradient,按照自己的工艺选择targetB(100)和length(10CV)(Fig 8)。Fig 8、AKTA Explorer的洗脱条件设定操作4)设定收集:选择Fracfractionation_900,输入每管收集体积,exectue(Fig 9)。结束固定体积收集选择Fracfractionation_stop_900,exectue(Fig 10)。Fig 9、AKTA Explorer的组分收集设定操作Fig 10、AKTA Explorer的组分收集停止设定操作5)清洗泵及卸下层析柱:将A1和B1入口放入纯水中,启动pump wash purifier功能冲洗A泵和B泵及整个管路。然后再将A1和B1入口放入20乙醇中,同样操作将乙醇冲满整个管路保存。再给柱子一个慢流速,设置系统保护压力,然后先拆柱子的下端,正在滴水的时候将堵头拧上,再拆柱子的上端,最后拧上上端的堵头。整个过程中应防止气泡进入。6)关闭电源:从软件控制系统的第一个窗口unicorn manager点击退出,其他窗口不能单独关闭。然后关闭AKTA主机电源,关闭电脑电源。3、程序设定操作在method editor窗口点击工具栏内的method wizard,弹出窗口界面如Fig 11所示,可以分别在main selection、column以及column position三个下拉菜单中选择所要用到的层析方法、所用到的层析柱的参数以及所安装的层析柱在柱位选择阀的位置,选好之后,点击next按钮进入下一步波长和溶液进口的设定(Fig 12),在此可以设定检测的波长,针对AKTA EXPLORER可以一次选择三个波长共同进行监控,并在此设定A泵和B泵的溶液进口,设定好之后,点击next,出现如Fig 13所示窗口,可以在此设定对层析柱进行平衡的条件。 Fig 11 Fig 12 Fig 13 Fig 14完成之后,点击next出现Fig 14的窗口,在此可以设定上样的条件,可选择的条件包括上样的方式,如上样环上样以及样品泵上样,对上样的体积也要进行设定。如果利用系统泵上样,在此无法进行设置,不过可以利用A泵和B泵的两个进口在后面的步骤中进行设置。在上步设置完成之后,点击NEXT出现如Fig 15所示窗口,这里是针对流穿组分收集所进行一些设置,针对安装的不同的收集器,具体内容可能有些差异,这里显示的界面是在安装了Frac-950收集器之后所出现的界面,设置完成点击NEXT出现如Fig 16所示的窗口,设置目标组分收集的一些参数,点击NEXT,出现如Fig 17所示的窗口,针对具体的洗脱条件可以进行设置。当全部设置完成之后,点击finish,弹出Fig 18所示的窗口,可以再一次对所进行的设置进行进一步的修改,完成之后点击按钮,完成程序存盘操作。至此完成洗脱程序的设定工作,在应用自动洗脱程序时,可在SYSTEM CONTROL窗口点击文件菜单栏中的FILERun,在弹出的对话框中选择目标洗脱程序所在的位置并执行,之后会依次弹出一些对话框,主要是再次确认程序的设置条件,并选择洗脱结果文件的保存位置,全部设置完之后,洗脱将自动进行,结果将自动的保存在设定的文件夹中。 Fig 15 Fig 16 Fig 17 Fig 184、结果的浏览与简单处理在纯化完成后,Unicorn软件会自动的按照预先的设置保存结果文件,如果没有指定,那么结果文件会保存于一个文件名以manual N开头的文件中,N为系统依次生成的一个1-10之间的数字。对于结果的浏览应在evaluation窗口(Fig 19)中进行,打开文件及对文件进行普通编辑的菜单如Fig 20所示。 Fig 19 Evaluation窗口Fig 20 纯化结果普通编辑菜单 这里已经选择了一个纯化文件,打开后,在结果浏览窗口点击鼠标右键,选择properties,可以弹出如Fig 21所示的操作菜单,可以分别对结果进行编辑,如改变曲线的颜色,设定横轴或纵轴的显示区间,进行文本文件的编辑等等。Fig 214、AKTA蛋白纯化系统的日常维护4.1 每天,当实验完成系统使用结束后,应尽可能避免保存于缓冲液中过夜,尤以高盐浓度洗脱缓冲液为甚!假如,不能避免,则紧记次日尽早用 System Wash Method完成以蒸馏水将系统彻底清洗,再予以保存或再更新使用其它缓冲液,再次投入使用进行实验操作。用蒸馏水将余下的缓冲液彻底冲洗出系统,这步骤至关重要。此举不但可以避免缓冲液对系统造成腐蚀机会,甚或因使用高盐浓度缓冲液保存过久造成盐结晶等的堵塞,对系统构成不必要的损害和损耗。4.2每周更换润洗缓冲液(20%乙醇)。若发现储液瓶液体增多,就说明泵内部有漏液,需要更换泵密封圈。若发现液体减少,需要检查润洗管接头,如果没有漏液,则泵膜或密封圈需要更换。4.3一定要保持实验环境的清洁,以免灰尘造或泄漏的液体等造成仪器光学及电子元件的损坏。4.4 在长时间不应用系统进行试验的时候,应将系统管路充满20%的乙醇,并关闭紫外检测器,清洗PH探头,并保存于适当的缓冲液中。
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