DNA重组与转座,概述,第一节 同源重组,第二节 位点专一性重组,第三节 转座作用,第四节 逆转录转座子,概述：, 只要有DNA，就会发生重组,减数分裂,高等Euk.体细胞核基因、叶绿体和线粒体,温和噬菌体,转座子转座, 生存变异突变，重组 损伤修复、适应环境、加速进化, 广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程,DNA重组 DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合。 （1）同源重组 （2）位点特异性重组 （3）转座重组 （4）异常重组, DNA重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）, 重组DNA技术,第一节 同源重组,1、 同源重组（homologous recombination）: 发生在同源DNA序列之间,一、特征,2、 特征：, 涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大, 涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程 异源双链区的生成, 存在重组热点, 需要重组酶, 单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号,细线期,合线期,粗线期,双线期,终变期, e.g. Euk.减数分裂时 的染色单体之间 的交换 细菌的转化， 转 导，接合，噬菌体 重组,双倍体染色体交换,二 同源重组的分子模型,1.Holliday于1964年提出Holliday模型 （1）两个同源染色体DNA排列整齐 （2）两DNA分子同一部位两单链发生断裂引发重组 （3）断裂的单链游离末端彼此交换形成Holliday中间体 （4）通过分支迁移产生异源双链DNA分子。 （5）中间体在内切酶和连接酶作用下，形成拼接重组体和片段重组体。,Synapsed chromatids,Recombination joint,Heteroduplex DNA,片段重组体,拼接重组体,Holliday中间体,Meselson-Radding模型 单链入侵模型（链转移模型）,置换,侵入,Loop切除,同化 异构化 分支迁移,5,切割,双链断裂修复模型,2、 分枝迁移和Holliday中间体结构的拆分, 分枝迁移（branch migaration） 双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散,Holliday的异构化,产生重组体的拆分,Holliday结构一经生成即可 不断地处于异构化异源双链 heteroduplex DNA,重组结果取决于拆分时 配对链上的切口位置,（1）,（2）,（1）,（2）, Holliday结构的拆分,产生含异源双链的片段重组体,产生拼接重组体,“亲本链-片段重组体”,“拼接重组体”,三、原核同源重组（E.coli）, 发生在双方DNA的同源区域,部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间 细菌的转化、结合和转导,1、RecBCD酶和 Chi 位点, RecBCD酶具有ATP依赖的解旋酶活性、依赖于ATP的核酸外切酶活性、序列特异性的单链内切酶活性., 单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链 RecA的作用位点, Chi位点含有GCTGGTGG序列,是基因recBCD编码RecBCD酶作用的靶位点,3, RecBCD的识别和切割位点,a、 RecBCD结合在DNA的平 头末端（产生机制不清楚）,b、 外切、解链、移动 （ATP）,c、 兔耳状 loop 结构产生 （再旋酶活性低于解旋酶活性）,d、 RecBCD 在 loop 单链区的 chi 位点3方46NT处切 断单链（单链内切酶）, chi位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点 E.coli 含 1000 个、Euk.,e、 RecBCD 切割产生3单链末端,2、RecA 蛋白,（1） 活性,a、 RecA 有单、双链 DNA 结合活性,b、 RecA 有 NTPase 活性（底物差异活性） 与单链 DNA 结合时活性最大-依赖于 DNA,c、 RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子 的能力，即联会同源 DNA （但其靶 DNA 必须有缺口结合DNA）,RecA,入侵单链,被置换连,RecA引发链侵入模型,RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end.,RecA启动的单链入侵,RecA引起的链交换和Holliday结构的生成,（2）RecA 蛋白催化双链和单链 DNA 的反应阶段,a、 联会前阶段（缓慢） RecA 与单链结合,b、 单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子 Holliday（5侵入）,c、 从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链 DNA 反应结束时，RecA 结合到双链上, 其中单链同化有固定的方向 入侵单链为53 双链 DNA 的互补链是35, RecBCD 和 RecA 的共同作用,3、原核同源重组的其它蛋白,需要 E.coli 中三个基因 ruvA,ruvB 和 ruvC 的产物,a、 RuvA 识别 Holliday 结构的连接点,b、 RuvB 为分枝迁移提供动力（ATPase 1020bp/s）,c、 RuvC 核酸内切酶-专一性识别 Holliday 结构的连接点 体外切段连接点以拆分重组体, E.coli 重组的各阶段 （损伤修复）,损伤DNA复制产生缺口,RecA链交换,第二次链交换,DNApol通过DNA合成填满缺口,RuvA,B分枝迁移,RuvC切割Holliday连接点,第二节 位点专一性重组,一、位点专一性重组（ site-specific recombination）,1、概念：发生在专一序列的DNA分子间的重组,有特异的 重组酶和辅助因子对其识别和作用。,噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组,2、位点特异性重组的结果依赖于重组位点的位置和方向,二、phage的整合与切除,1、实现机制：,均是通过-细菌DNA和DNA上特定位点之间的重组,2、特定位点-附着位点（attachment site att）, E.coli attB 含BOB序列 23bp, phage attP 含 POP序列 240bp, 核心序列 “O区”完全一致 （同源部分15bp） -位点特异性重组发生的地方,3、整合过程, 整合后的附着位点为 attL（BOP） attR（POB）, 整合位点-attB、attP 切除位点-attL、attR, 整合过程需要整合酶 （integrase Int）（编码） 和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用,溶源性细菌 (lysogen),溶菌周期 （lysis）,原噬菌体,4、整合分子机制, 核心序列O全长15bp，富含A-T, 发生在O内的重组交换位点相距 7bp, 整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同), attP位点的负超螺旋为重组所必须-加强了Int和IHF的亲和力 -高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构, Int结合 -核心序列的反向位点（切割位置） -结合在att臂上（臂与核心区靠近）,Xis, 整合体及其作用 整合体（intasome）- Int和IHF结合到attP时的复合物, 整合体捕获attB 说明- a、attB和attP的最初识别靠Int 识别两序列的能力 b、两序列的同源性在链交换时为 重要因素, Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分, 重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交,5、整合与切除的控制,（1） 整合, C-促使阻遏蛋白C的产生 -与int gene 的PI结合，转录产生Int蛋白 -且PI位于xis基因内，C与PI结合导致xis gene失活,（2） 切除, 寄主SOS反应时-RecA大量产生，促使阻遏蛋白C的水解 -把OL和OR从阻遏状态释放出来 -从PL转录使int和xis表达,细菌的特异位点重组鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白H1和H2转换,四、依赖于同源重组的位点特异性的序列代换 -酵母MAT序列的转换,1、 酵母结合型的转变-DNA序列的代换，而不是互换 -依赖于序列的同源性 （被代换的序列命运是被降解-突变试验）,2、 同源序列,匣子 W X Y Z1 Z2 total HML 723 704 747 239 88 2501 MAT 723 704 747 239 88 2501 MATa 723 704 642 239 88 2369 HMRa 704 642 239 88 1585,3、 转换过程, 内切酶(HO)识别、切割-Y/Z1交界处-起始MAT序列的转换 (双链断裂) HM匣子受Sir阻遏蛋白的保护, Y区域被降解，直到Y和Ya相同的部分或一直到X区域, 四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对, 以供体DNA为模板复制Y区域，holliday结构形成, Holliday结构的拆分，产生新的MAT匣子和这次转换中的供体匣子,4、 特征-同源重组和位点特异性重组特征都具有, 需要大范围的同源序列, 需要重组酶系（rad52基因产物、位点特异性的HO内切酶）,第三节 转座作用,一、转座子概述,1、转座子(元)或转座元件(transposon or transposable element): 基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直 接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）,转座（transposition）：转座子的转移过程,2、发现和发展, 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉层花斑突变,玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理,跳跃基因（jumping gene）, 1947 冷泉港实验室（美） Barbara McClintock, 基因转座现象的再次发现与证实,在一个操纵子中， 与操纵基因毗连的结构基因发生终止 突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响 其后结构基因多肽的翻译，并且具有极性梯度的特征。,插入型极性突变的发现与机理,Operon & Polarity Mutation,20世纪60年代末期,在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子 1983年Barbara McClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖。,a) 不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性,b) 转座不是简单的转移，涉及转座子的复制,Hotspots (热点) Regional preference ( 在3kb区域内的随机插入),d) 某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性 （免疫性）,e) 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复,f) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应,3、转座重组的特点,c) 转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）,二、Prok.转座子种类, 两种类型： 简单转座子（simple transposon） （插入序列 insertion sequence IS ） 复合转座子（composite transp