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临床微生物检验与临床,临床微生物科 李 浩,微生物检验的重要性,在医学高度发展,新的抗菌药物不断涌现的今天,感染性疾病的发病率和病死率仍然居高不下。主要原因之一是当代的感染性疾病,在病原上发生了较大的变化,形成了现代感染性疾病在病原学上的新特点,现代感染性疾病的新特点,以条件致病菌为主:很多低致病、弱毒的细菌,在外环境、人体体表以及与外界相通的腔道中广泛存在的细菌,引起感染甚至造成严重后果的现象日益增多。 病原菌的种类更为广泛:包括需氧菌、厌氧菌、苛氧菌、分枝杆菌和真菌等。,细菌的耐药性不断增强:同一种细菌对抗生素的耐药性可以完全不同,甚至出现同时耐多种抗生素的“多重耐药”细菌,往往使临床医师的“经验性”治疗或所谓的常规治疗根本无效。,现代感染性疾病的新特点,提高感染样本送检率 加强细菌耐药监测 关注细菌性疾病的病原学诊断,已成为临床工作者、临床微生物与微生态工作者、药学家和从事感染控制的工作者共同关注的热门焦点。,病原微生物送检是感染控制的基础,成功治疗感染症的因素 成功分离病原菌 标本收集、运送、保存 标本处理方法 检验医师专业知识 医师判读病原菌培养结果 选择适当治疗方法,临床医生要合理用好两种数据,1. 本地区、本单位病原流行病学资料,指导经验用药。(微生物室、院感科、临床科室) 2.药敏试验报告,纠正经验用药。 重视病原学检查,尽可能在应用抗菌药物之前留取标本送检。以提高病原学诊断率,为选药和调整药物提供依据。,“正确的微生物学检验始自正确的标本采取。临床医师、护师及检验技师都必须通晓其要领。” 著名的临床微生物检验专著Manual of Clinical Microbiology 的主编Patrick Murray,标本采集和运送是细菌培养成功的最最重要的关键 但由于标本的采集和运送常由护士或医生或病人自己完成,所以也是最不容易做好的事情,而且不知道问题所在之处,造成的后果是: 临床医生最不能接受的问题:阳性率低,国内微生物标本的采集目前存在的问题 : 标本送检率低 从全国来看,抗感染治疗前,送检相关标本可能只占应送标本的一半左右,与抗菌药物应用率之高形成鲜明的反差。一些医师在经验性治疗受挫后方送标本,此时已失去阳性培养的机会。 标本有缺陷 正确收集各种临床标本,关注特检标本采样与送检的方法和条件,是完成病原学诊断的先决条件。,微生物让人类步步为营, 我们应该追求: “准确的病原学诊断” “针对性病原学治疗” 正确的微生物标本采集和运送,是准确的病原学诊断的前提!,基本原则,1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.采样后立即送检 5.标本容器须灭菌处理,但不得使用消毒剂 6.送检标本应注明来源和检验目的,常见不合格标本主要有以下问题:,标本采集时间错误 容器错误 标本量不足 标本采集延误 标本未及时正确运送 以及暂存条件错误。 。,最有价值的细菌学检测项目,血液培养 脑脊液培养 胆汁培养 胸腹水培养 关节液 其他无菌体液或分泌液,血培养标本,采集与运送,血培养是进行血流感诊断的最佳手段,目前血培养的问题:,采血时机不合适 采血套数不够 采血量不足 只做需氧培养,不同时做厌氧培养 采血前或采血时正在使用抗生素治疗,相似规模医院的血培养数, 国内多数三甲综合医院210 瓶/天 复旦大学中山医院2050瓶/天 香港玛丽医院200瓶/天 台湾大学医院300瓶/天 我院约1015瓶/天,1370瓶/2011年7月26日 美国,亚特兰大,埃默里大学附属一院,1100床位,平均100 人次/天 美国,亚特兰大,埃默里大学附属二院,900床位,实验室类型:美国私立大医院微生物实验室医院病床数: 800 beds微生物标本量: 600个标本/天血培养标本量:150 瓶/天血培养标准采样:3套瓶/24小时 (1个需氧瓶+1个厌氧瓶=1套)阳性结果:10-30株需氧或兼性厌氧菌/天, 2株厌氧菌/月BacT/ALERT 3D 240 7台,“只有在发热时,才需要进行血培养。”,关于血培养指征,想采就采,?,答 案:血培养的指征,当怀疑血流感染或脓毒症时,应常规行血培养 怀疑患者有血流感染的症状有: 不明原因的发烧(38)或体温过低(36) 白细胞增多( 10,000/ul),粒细胞减少( 1,000ul) 休克,寒颤,僵直 严重的局部感染(脑膜炎,心内膜炎,肺炎,肾盂肾炎,腹部术后感染,) 心率异常加快 低血压或高血压 呼吸频率加快,“何时采血进行血培养,无特殊时间要求。”,关于采血时机,?,你认为对吗?为了提高病人血培养的阳性率,最好的抽血时间是:,A.发热开始时B.寒战开始时C.发热最高峰时D.寒战结束时E.预计寒战发热前,0,30,60,时间 (分钟),体温,血培养采血时机,细菌浓度,答 案:采集血培养样本的最佳时间,尽可能在患者寒战或开始发热时采血 在患者接受抗生素治疗前采血 如患者已经应用抗菌药物进行治疗,应在下一次用药之前采血培养,“为减轻患者痛苦,只从一个穿刺部位采一份血液标本即可。”,关于采血套数及部位,?,基本概念,成人“一套” 血培养应该包括需氧瓶和厌氧瓶各一个,也叫“一份” 注意:一次穿刺采血,算“一套”,采集第二套应从另一个穿刺点获得。 儿童一般只做需氧培养,但仍需从多个部位采集多次。特殊患者才考虑厌氧培养。,采血套数,Weinstein et al. Detection of Bloodstream Infections in Adults: How Many BloodCultures Are Needed J Clin Microbiol. 2007; 45:3546-3548,表皮葡萄球菌的临床意义,23套血培养,有助于污染的判断。,Tokars, JI. Clin Infect Dis 2004; 39:333,污染菌,致病菌,?,采集1套无法判断是病原菌还是污染菌。,答 案 :关于血培养套数与采血部位,每位患者每次采血最少2套,3套更好 初发患者,绝不能只采1套标本 多个穿刺部位采血。因多部位同时发 生污染的几率较小,便于对结果进判断,“两套血培养采集间隔无特殊要求。”, 关于采血间隔,?,答案:关于标本采集间隔时间,对于非持续性菌血症,同时或短时间内采集23套血培养,因为体内巨噬细胞吞噬系统会在1530min内清除掉进入人体内的细菌。 可疑急性心内膜炎患者要立即取血作血培养,30分钟内完成3套血培养的采集,采集后立即进行抗菌药的经验治疗。如果24小时内报告阴性,则继续采集2套血培养。 可疑的亚急性心内膜炎患者每间隔30分钟至1h采集1套,连续采集3套标本。如果24小时内报告阴性,则继续采集2套血培养。,“每瓶采集多少血液无特殊要求。”, 关于采血量,?,菌血症病人血中细菌浓度 成年病人: 链球菌心内膜炎 1 to 30 organisms/ml 葡萄球菌心内膜炎 1 to 20 organisms/ml 革兰氏阴性菌血症 少于1 to 10 organisms/ml 革兰氏阳性菌血症 1 to 300 organisms/ml 幼儿病人: 革兰氏阴性菌血症 5 to 1000 organisms/ml 75%幼儿菌血症病人血液有100 organisms/ml 所以采血量一定要足够!,采血量(ml)与检出率的关系,Overall,血培养物每增加一毫升,真性菌血症 成年人微生物的检出率增加3,但并非越多越好,超过一定数量的采血量会稀释培养瓶内的肉汤,使肉汤无法有效中和血中的抑制物质(补体、抗体、抗生素)。所以血液与肉汤的最佳比例为1:41:10,答 案:关于采集血液量,采血量是影响灵敏度最关键因素 成人一份标本2个培养瓶(需氧厌氧),每瓶810ml,共20ml;要求至少采两份标本,即40ml。 儿童一般只需采集需氧瓶,在保证采集血量1总血量下,一般为13ml 采血量不足时应优先保证需氧瓶,因临床90以上的感染为需氧菌或兼性需氧菌感染,先采生化、凝血标本,再采血培养标本。”,关于各种血液标本的采集顺序,?,血培养对无菌操作的要求比注射、采集生化、凝血等其它标本要高。 所以要最先采集血培养标本。 污染率的指标是 3% (100份标本里只能有不到3个标本出现污染。),答案:采各种血液标本的先后顺序,“消毒的重点是足够量的消毒剂。”,关于皮肤及培养瓶消毒,?,皮肤消毒程序:,推荐使用碘町、洗必泰或碘伏作为皮肤消毒剂。 碘町作用1min 碘伏作用1.5-2min 洗必泰作用时间与碘町一样(但不能用于少于2个月婴儿皮肤消毒),培养瓶的消毒程序:,去掉培养瓶口的塑料瓶盖。 75%酒精消毒血培养瓶橡皮塞子60秒。 自然待干。 将标本注入培养瓶内。 5. 颠倒混匀标本与肉汤,以避免血液凝集。,“培养瓶未使用时,需要冷藏或冷冻。”,关于培养瓶的储存温度,?,不需冷藏,更不能冷冻。保存在1525的室温即可,温度过低会导致对温度敏感的耐瑟氏菌等死亡。,答案:关于未用培养瓶的储存温度,“加入标本后的培养瓶夜班未能及时送到检验科,可以冷藏或放入35的温箱。”,关于夜班血培养的送检,?,培养瓶夜班未能及时送到检验科,存在室温即可,不能冷藏也不能放入35 的温箱 。过夜不会对检测造成影响,但仍需尽快送检。冷藏可能导致对温度敏感的耐瑟氏菌等死亡。温箱会导致细菌进入生长对数期,从而错过检测的最佳时期。,答案:关于夜班血培养的送检,“患者静脉中插有导管,可直接从导管采血。”,关于采血部位,?,不可以,常规血培养不宜从静脉导管或静脉留置装置中采集,检出污染或定植菌的可能性较大。除非怀疑导管相关性血流感染,请参照导管相关性血流感染的采血方法。,答案:关于从静脉留置装置直接采血,有临床意义的分离株Bourbeau PP et al. Routine incubation of BacT/ALERT FA and FN blood culture bottles for more than 3 days may not be necessary. J Clin Microbiol. 2005; 43:2506-2509,结果表明培养的前三天,有临床意义分离株的97%被检出,培养前两天的检出率为94%。,97,痰培养标本,采集与运送,病原体种类繁多而复杂,使下呼吸道感染病原诊断成为难题,细菌(包括放线菌与奴卡菌,厌氧菌与分枝杆菌) 真菌(包括肺孢子菌) 病毒 支原体、衣原体与立克次体 原虫 寄生虫,咳痰途经口咽部,唾液中口咽部定植菌的浓度可达108-109/ml。 研究显示,国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。,不可避免地受到污染,我国痰细菌培养现状,标本送检率低 苛养菌检出率极低 结果重复性差 报告速度慢 感染菌与污染菌不易区分 药敏结果与治疗反应存在差距,咳痰标本的采集,标本采集方法 医师或护士直视下采集标本 病人先漱口,去除表面的菌群 教育病人深咳,收集从下呼吸道咳出的痰液 临床上约半数咳痰标本不合格!,关于咳痰标本,在抗生素应用前采集痰标本; 标本采集后12h内必须立即进行实验室处理 咳痰标本应用最早且广泛,但也是最受争议的标本 取标本前应摘去牙托,清洁口腔如刷牙和漱口 深咳,采集标本过程中要有专业的医务人员指导 无痰可用35NaCl 5ml雾吸约5min导痰 也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰,几种下呼吸道直接采集的标本,经气管穿刺吸引(transtracheal aspiration,TTA) 经胸壁针刺吸引(transthoracic needle aspiration, TNA) 经支气管镜采样 支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage, BAL) 经支气管镜直接吸引 防污染样本毛刷(protective specimen brush, PSB) 开胸肺活检(open-lung biopsy,OLB) 经人工气道吸引分泌物(
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