第22章 免疫学检测原理,免疫学检测是指借助免疫学、细胞生物学、分子生物学等理论或方法，对抗原、抗体、免疫细胞及细胞因子等进行定性、定量检测。临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾病的诊断、病情检测和疗效评价等。,第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法 第二节 免疫细胞检测 第三节 分子生物学技术在免疫学上的应用,本章内容,第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法,一、抗原抗体反应概念 抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。,二、抗原抗体反应的特点 高度特异性 可精确区分物质间极微细的差异。 表示为 亲和力：一个抗原表位与相应抗体单一抗原结合位点间的结合能力。 亲合力：指一个抗体分子与整个抗原大分子间的结合强度，与抗原表位数目有关。,2.抗原抗体结合的带现象与可见性,抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体浓度和比例（等带）决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应；,3. 表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、范德华力和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。 抗原抗体反应的2个阶段 第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。,三、抗原抗体反应的影响因素 电解质 抗原抗体等电点分别为pH3-5和pH5-6，在中性或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而相互结合； 温度 通常为37，适当提高反应温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，但56以上可使抗原或抗体变性失活； 酸碱度 抗原抗体反应的最适pH值在6-8之间，pH值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。,四、抗原抗体反应检测技术的应用 抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。,五、抗原-抗体反应的基本检测方法,特异性,结合力的表示方法,亲和力和亲合力,Ag-Ab反应的原理,Ag-Ab反应的可见性,1.凝集反应,直接凝集反应,1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16,细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下直接反应，二者比例合适时，出现肉眼可见的凝集团现象。,玻片法,试管法,常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定,选择最佳稀释浓度，常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。,间接凝集反应,将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。 凝集反应常用于溶血性疾病的诊断：,+,病人的RBC,体内anti-Rh,由于抗体多属于IgG，分子量较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现凝集,+,Y,体外加入抗人IgG,出现凝集现象，叫直接库姆试验,正常人O型血的Rh+的RBC,+,患者血清内的游离anti-Rh,+,Y,体外加入抗人IgG,出现凝集现象，叫间接库姆试验,2.沉淀反应,单向免疫扩散,双向免疫扩散,免疫比浊,过量Ab Ab Ab Ab,毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。,鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同,用于确定抗原浓度,沉淀反应免疫电泳,存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。,3.免疫标记技术,免疫酶测定法 免疫荧光技术 放射免疫测定法 免疫胶体金技术,免疫酶测定法,夹心法ELISA 间接ELISA BASELISA 利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁 微粒捕获酶免疫分析技术 将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素、亲和素、酶相结合，最后酶作用于荧光底物发光，通过检测荧光强度判断未知抗原的含量。,免疫组化技术,定位、定性、定量检测,免疫荧光技术,放射免疫测定,用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。,化学发光免疫技术,将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。 灵敏度高、简便、可实现自动化分析。,免疫胶体金技术,用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。 氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。 该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。,免疫印迹法-Western blotting,4.蛋白质芯片技术,又称为蛋白质微列阵，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微列阵。根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。,第二节 免疫细胞检测,淋巴细胞及其亚群的分离,免疫细胞 功能测定,磁珠分离法,免疫吸附分离法,流式细胞术,肽MHC四聚体技术,T细胞功能测定,B细胞功能测定,细胞因子检测,T细胞增殖试验,迟发型超敏反应的检测,抗体含量测定,溶血空斑试验,巨噬细胞吞噬试验,细胞毒试验,吞噬功能测定,51Cr释放法,乳酸脱氢酶释放法,细胞染色法,凋亡细胞检测法,硝基蓝四氮唑试验,生物活性检测法,免疫学检测法,一、免疫细胞及其亚类计数,外周血单个核细胞的分离,外周血单个核细胞的分离,磁珠分离法,免疫吸附分离法,流式细胞术,肽MHC四聚体技术,淋巴细胞及其亚群的分离,免疫吸附分离法,加入淋巴 细胞悬液,磁珠分离法,流式细胞术,荧光抗体标记混合细胞,喷嘴,单细胞悬液 5000-10000个/秒,细胞分选器,荧光,检测器,抗原肽-MHC四聚体分离技术,亲和素,抗原肽,MHC I,生物素,荧光素,二、免疫细胞功能的测定,T细胞功能测定,B细胞功能测定,细胞因子检测,T细胞增殖试验,迟发型超敏反应的检测,抗体含量测定,溶血空斑试验,巨噬细胞吞噬试验,细胞毒试验,吞噬功能测定,51Cr释放法,乳酸脱氢酶释放法,细胞染色法,凋亡细胞检测法,硝基蓝四氮唑试验,生物活性检测法,免疫学检测法,T细胞功能测定,T细胞增殖试验,迟发型超敏反应的检测,T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测： 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁； 3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。 MTT (四甲基偶氮唑盐)比色法：,外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染。,B细胞功能测定,抗体含量测定,溶血空斑试验,可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。,绵羊红细胞(SRB C)免疫动物,4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞,脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀,在抗体形成细胞周围出现溶解的透明区，即溶血空斑。1个空斑区代表1个浆细胞,通过记录溶血空斑的数目可知抗原特异性B细胞的数目,加入新鲜补体，倒入平皿中培养,细胞毒试验,51Cr释放法,乳酸脱氢酶释放法,细胞染色法,靶细胞被杀伤后，向体系中加入台盼兰，可进入膜破损的细胞内，将细胞染成蓝色。活细胞拒染而不着色。,凋亡细胞检测法,琼脂糖电泳法,凋亡细胞,巨噬细胞吞噬试验,吞噬功能测定,硝基蓝四氮唑(NBT)试验,NBT在杀菌过程中产生反应性氧中间物，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中。光镜下计数NBT阳性细胞可反映PMN的杀伤功能。,将待测mf与鸡红细胞混合温育后，鸡红细胞被mf吞噬，根据吞噬百分率确定mf吞噬能力。,吞噬百分率=吞有红细胞的mf/mf总数,细胞因子检测,生物活性检测法,免疫学检测法,夹心ELISA或ELISPOT,荧光素标记抗体染胞内细胞因子，FACS分析,细胞增殖或增殖抑制法，如细胞因子依赖性或抑制性细胞株,细胞病变抑制法，如感干扰素抑制病毒感染性细胞损伤,检测B细胞产生的抗体,检测T细胞产生的CK,酶联免疫斑点试验-ELISpot,对血细胞恶性变如白血病 、淋巴瘤等的诊断，长期以来多应用细胞形态学检查和免疫细胞表型分析。由于这些方法在特异性和敏感性上的限制，对于丢失了细胞表面标志，或分化较好难以和正常细胞区别。也可能由于恶性细胞数量少，混在大量正常细胞中难以查出。,第三节 分子生物学技术在免疫学上的应用,一、BCR和TCR基因重排检测 利用分子生物学，获得Ig片段的特异基因克隆及TCR各链的基因克隆，分别应用Ig基因和TCR基因重排作为B细胞和T细胞的特异标记，分别诊断B细胞来源和T细胞恶性病变引起的白血病。,具体操作： 从待检的细胞中分离出总DNA。非T、非B细胞的Ig和TCR基因不发生重排，称为胚基因。而T和B细胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排，重排后的Ig和TCR片段，转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，然后用同位素或酶标记的Ig血病细胞进行分类鉴定。若有Ig基因重排说明恶性细胞来源于B细胞，若有TCR基因发生重排，则为T细胞来源的。如果既无Ig基因重排，又无TCR基因重排的淋巴细胞则属非T、非B细胞来源的瘤细胞。,二、限制酶切片段长度多态性组织配型法 HLA类重链基因的核苷酸序列有高度同源性，由这些基因片段克隆得HLA类专用的探针。 由于HLA等位基因的多态性表现在其核苷酸序列的差异，被限制性内切酶作用部位（切点）不同，这种酶切点只有46个核苷酸长度，因此来源于不同HLA单倍型的DNA可被一种内切酶切成不同长度的片段。,主要包括4个步骤： 提取细胞总DNA，用限制性内切酶消化； 凝胶电泳； 将凝胶中分离好的DNA片段转移至尼龙膜上； 经变性处理后用同位素标记的探针进行分子杂交。经放射自显影，得到显影带。即可得知分子量大小不同的DNA片段。,