1,破解呼吸道感染病原学诊断的困境：需要你我他,王 辉 北京大学人民医院检验科 Email：,L.CN.MKT.GM.04.2016.5059,2,内 容,呼吸道感染病原学 困境和挑战 可能的破解之道,2,王辉-实验诊断学,3,The Three Most Important Elements in Practicing Medicine,William Osler, The Principles and Practice of Medicine, 1892,Diagnosis!,Diagnosis!,Diagnosis!,Medicine is a science of uncertainty and an art of probability.,最重要的是不要看远方模糊的事，而是做好手头清楚的事,4,欧洲流调：CAP的主要病原体,病原体检出率(%),一项1996年11月至2008年7月在西班牙进行的CAP流调研究，纳入3,524例CAP患者(15%门诊患者,85%住院患者) ，其中1,463例患者病原学呈阳性反应。,Cillniz C, et al. Thorax. 2011;66(4):340-346.,肺炎链球菌和非典型病原体是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位,N=1463,5,我国CAP的主要致病菌,病原体检出率(%),入选2003年12月至2004年11月中国7个城市12个中心的665例CAP患者并进行病原体检测,2006年我国CAP的大型流调研究显示：肺炎支原体是我国CAP的最主要致病菌，其次为肺炎链球菌1 在我国已经完成的另两项全国多中心成人CAP调查中，肺炎支原体感染的比例分别达到了20.7%和38.9%，均已超过了肺炎链球菌(分离率分别为10.3%和14.8%)，成为成人CAP最常见的致病原2,3 混合感染在社区呼吸道感染中占有重要地位，以细菌合并非典型病原体混合感染居多1,1.刘又宁 陈民钧 赵铁梅等. 中华结核和呼吸杂志.2006;29(1):3-8； Liu Y et al. BMC Infectious Diseases. 2009;9:31. 3. Tao LL et al. Chin Med J (Engl). 2012;125(17):2967-2972.,6,成人病毒性肺炎发病率高，但长期被忽视,每年新发病毒性肺炎约200万例，其中成人和儿童各100万例 10项成年人CAP综述（共2910例），病毒性肺炎占22%,Jennings LC , et al. Thorax 2008; 63:42-8. Ruuskanen O. Lancet 2011;377:1264-75.,6,7,北京市成人CAP监测网：病毒性肺炎27.5%,2010-2012年本课题组牵头，联合北京市12家医院 954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。 重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。,JiuXin Qu. BMC Infect DIs 2015 online first,7,8,上呼吸道标本类型及适应症,8,上呼吸道感染标本的采集,9,用拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁（3-5次）,咽拭子的采集方法,咽拭子的采集,正确拿咽拭子的方法,错误拿咽拭子的方法,上呼吸道感染标本的采集,上呼吸道感染标本的采集,11,请患者头部保持不动，将拭子轻轻转动缓缓插入患者鼻腔，不要用力， 当遇到阻力后即到达后鼻咽，停留数秒吸取分泌物，轻轻旋转取出拭子,鼻 拭 子 标 本 的 采 集,病毒：选用涤纶或人造棉头塑料柄的拭子（如：聚丙烯纤维头），不能用藻酸钙及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反应。脱脂棉拭子含有荧光物质，影响荧光定量PCR结果 细菌：选用藻酸钙拭子。棉拭子、尼龙拭子可抑制百日咳博德特菌生长 采样后用于病毒检测的拭子，将拭子头浸入含一定量采样液的螺口管中，尾部弃去，旋紧管盖，及时送检，如不能立即送检，可暂时储存于4冰箱内，严禁-20 冷冻。用于细菌检测的拭子插回采样管中或适宜的转运装置中，立即送检,12,上呼吸道感染标本的采集,支原体保存液,病毒采样拭子,细菌采样拭子,13,下呼吸道标本类型及适应症,13,14,下呼吸道标本类型及适应症,14,下呼吸道标本中， 痰27(1)：69-86,22,指南中强调：血培养至少送2套,在发热开始的24 h内进行血培养。 尽力保证在抗感染治疗前获得首份血培养标本。 同时经2个独立部位抽取血标本，此结果比单一部位的血培养更有临床意义。除外新生儿外，不建议只进行单套血培养（级）。 48-96 h后评估治疗效果，再次血培养不能单取1套，必须同时抽取2套标本（级）。 但对怀疑血管内的感染，则应该间隔一段时间取不同部位的静脉穿刺抽血，有助于诊断持续性菌血症（级）。,Crit Care Med 2008 Vol. 36, No. 4；CLSI指南；英国指南,23,“双抽四瓶”，每瓶8-10ml 标示“左侧”、“右侧” 无菌体液 如胸水等,手 册 宣 讲,24,痰标本在病原学诊断中面临的困难,CAP患者40%以上患者无法或及时产生痰 痰标本合格率较低，甚至送检唾液 培养：痰培养阳性率受多种影响因素影响且影响极大，包括标本采集、运输、快速处理、合理应用细胞学判断标准、前期无抗生素治疗、解释技能 涂片革兰染色：最新数据表明，通过革兰染色辨别1669个CAP住院病人合格标本，只有14%可以辨别出主要形态类型,24,American Thoracic Society, Infectious Diseases Society of America. Guidelines on the Management of Community-Acquired Pneumonia in Adults, 2007:44 (Suppl 2),25,痰标本不同外观,25,唾液,脓痰,粘液样痰,带血痰,26,26,标本质量评估痰涂片,Garbage in！,唾 液,27,一个小调查,随机调查中国15家医院2014年痰标本数据,27,28,痰标本判读标准的比较,28,29,合格痰标本：吞噬很重要,29,WBC内吞噬：葡萄球菌,30,涂片项目报告格式,30,普通细菌涂片及染色,31,痰培养标本质量情况,13家医院，痰标本合格率不足50%,32,粒缺患者肺炎的致病菌,Curr Opin Pulm Med 2015, 21:260271,33,对于确诊IA：GM的诊断效能,Curr Opin Pulm Med 2015, 21:260271,34,粒缺肿瘤肺炎：微生物学评价,BAL是很好的诊断工具,Curr Opin Pulm Med 2015, 21:260271,35,恶性粒细胞减少患者的肺炎诊断,临床评估+微生物学评估+分子 微生物学评估： 最可靠：从无菌部位分离or呼吸道分泌物中非共生菌 BAL是首选下呼吸道标本，越早采集越好，尤其使用抗生素之前，但不能延误治疗 支气管活检（TBBX）可揭示侵入血流感染，但培养不优于BAL，且因为恶性粒细胞减少继发血小板减少使得并发症风险高 分子方法：半乳甘露聚糖分子试验测试侵袭性曲霉病（FDA已经批准）,Scott E. Evans and David E. Ost, Pneumonia in the neutropenic cancer patient, Infectious diseases, 2015,21(3):261-271,36,日均痰标本与BAL送检对比,36,BAL标本量要求,生理盐水总灌入量不少于100ml，分3-5份进行（标准为200-240ml，分4等份进行） 好的BAL标本，至少30%灌入液回收 30%回收率的被视作不合格，需要重新采集（尤其是10%回收率的标本）,Meyer KC, An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease, Am J Respir Crit Care Med. 2012 May 1;185(9):1004-14,38,肺泡灌洗液标本的优点,BALF 标本培养的阳性率高，合格率高 BALF 的采集不需要患者的配合【1】 BALF能避免上呼吸道的定植菌的污染，减少对培养结果判断的干扰。,38,1. American Thoracic Society, Infectious Diseases Society of America. Guidelines on the Management of Community-Acquired Pneumonia in Adults, 2007:44 (Suppl 2),39,肺泡灌洗液标本的处理,39,将所有标本装入50ml离心管内,漩涡震荡30-60s,每个平板定量涂10L,Use pipette. 用吸管吸取0.1ml至1mlTSB （1：10稀释）,生长出10个菌落 培养后菌落计数： 相同形态菌落数103CFU/mL,制作涂片 （细胞离心),血平皿,巧克力平皿,麦康凯平皿,若用接种环密涂平板， 生长的菌落数量会低于实际数量。但用 L 棒涂布平板计数， 定量培养结果更准确,40,肺泡灌洗液的涂片革兰染色,适量BALF标本进行细胞离心，经自然干燥、甲醇固定或火焰快速固定3次，革兰染色 标本质量判断以扁平鳞状上皮细胞占全部细胞比例1% 为合格标本 敏感度为104个细胞/mL，若每个油镜视野可见1个或多个细菌，报告革兰染色形态及白细胞结果，提示此菌与活动性肺炎相关。,40,Patrick RM. Manual of clinical microbiology. 9th ed. US: ASM Press, 2007: 307- 308 中华人民共和国卫生行业标准下呼吸道感染细菌培养操作规范S.,41,肺泡灌洗液定量培养的意义,细菌性感染，浓度阈值104CFU/mL，低于阈值浓度时，定植可能性大; 高于阈值时，感染可能性大。 真菌性感染，目前没有BAL的诊断性阈值。 丝状真菌也没有阈值。但丝状真菌在呼吸道分泌物中的价值远大于酵母菌属。该类菌在 EORTC /MSG 指南中有“临床诊断( probable diagnosis)”价值,41,1. A Guide to Utilization of the Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases: 2013 Recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM), 2013:57(15 August) 2. EORTC /MSG,王辉-感染医师培训,42,培养与涂片结果不符：重新读片,中华结核和呼吸杂志,2011,34(9),43,哮喘患者：结晶和库什曼螺旋体,王辉-感染医师培训,44,有意义的细菌浓度值（CFU/ml）,标本,有意义的浓度 CFU/ml,自然咳痰,107,诱导痰,不确定,气管内吸取物,106,支气管肺泡灌洗液,104,保护性毛刷,103,支气管灌洗液,不做培养,FilmArray Respiratory Panel,第一个用单个标本同时检测病毒和细菌性呼吸道感染的测试 2min上机时间，1h周转时间 300l样本（鼻咽拭子即可）,http:/www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm304177.htm ,46,