PCR 污染防治手册 一、为什么要如此重视防治 PCR 污染？ 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA 片段 的方法。扩增过程中，扩增的 DNA 产量是呈指数上升的。PCR 产物的浓度一般为 1013 拷贝 /ml，而 1mg 人基因组 DNA 才含 1.4*106 拷贝的单拷贝基因片段，因此使得 PCR 扩增反应 的敏感性非常高。正是由于 PCR 反应具有强大的扩增效率也导致其及易污染，极微量的 PCR 产物污染便可导致假阳性结果。在应用 HPV 分型试剂盒的过程中，主要存在两个污染源： 1.标本间的交叉污染； 2.PCR 扩增产物的污染。其中以第二个污染源为最为常见，通过下 面一个例子便可认识到 PCR 产物污染的严重性。在 100ml 的反应管中可产生 1012 拷贝个分 子，若将这些分子在一个标准奥林匹克游泳池（50m*25 m *2m）内稀释后，0.1 ml 稀释液 含有 400 拷贝的扩增分子，远远超过了 PCR 扩增反应检测数个拷贝的极限。因此，一定要 注意产物残留污染的问题，对临床实验室尤应如此。 二、PCR 污染的来源 对于 HPV 分型检测试剂盒来说，污染的来源主要是 PCR 扩增产物的污染，常见的污染 途径有两种，一是气溶胶污染，在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈 地摇动反应管，开盖时、吸样时及受污染的进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计 算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。二是 PCR 产物的粘带污染，此类污染多是因为没有严格遵守分区规定，造成 PCR 产物扩散到样 品抽提或 PCR 实验室。实验大衣、手套、移液枪、枪头、枪头盒和试管架都是常见的粘带 污染源。污染发生时，这些地方是重点怀疑的地方。 三、PCR 污染的追踪 如果不慎发生或者怀疑有污染发生，可以设计一个简单的小实验以确认污染源。 用 HPV 的 PCR 扩增系统扩增如下模板： A:水-作为阴性对照，如果此管扩增出阳性，则可以判定为试剂已经污染或者是气溶 胶污染。 B:阳性样品-作为阳性对照，验证实验是否成功。 C-X:-所要检查的地方，用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源，0.1ml 去离子 水浸泡后作为模板。常见的需要检查的地方为各个实验台面、移液枪、枪头、枪头盒、试管 架、冰箱内、冰箱把手、水浴锅、抽提的相关试剂以及相关人员的办公桌。 如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中 PCR 产物 的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，可以在室内加装紫外灯管照射 过夜且彻底通风并停止几天的实验。 四、PCR 污染的预防 进行 PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的 PCR 污染或杜绝污染的出现。,1,1、划分操作区：实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔 离区内进行, 最基本的一个原则就是 PCR 扩增及杂交检测区的东西是属于污染源，绝对不可 以带到前两个区去。 A：样品制备区，包括扩增摸板的制备； B：PCR 加样区，包括反应液的配制和 PCR 扩增； C：PCR 扩增及杂交检测区,杂交操作过程在这个地方完成。 分区的注意事项： 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备PCR 扩增 产物分析产物处理。 样品的保存应该在上述三个区以外单独的区域。 各个区域的物品及衣服必须严格遵守单向的原则。 各个区域必须要自己单独的实验衣，实验时必须戴上手套。 每个区域要有自己单独的实验设备。 以下是常见的分区方式：,图二,项：,套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；,吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，,实验操作 戴一次性手 使用一次性 免气溶胶的,污染；,C: 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不 小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； D: 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证 PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增 系统的可信性； E:尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本 DNA 的 污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少应经常的擦洗 枪外表及枪管内。 3、严格对 PCR 产物的处理： PCR 产物包括杂交产物，在读数结束后，杂交产物或 PCR 产物应该用一次性密闭容器（垃 圾袋、自封袋）装好后丢弃或者倒至 1 mol/L HCl 溶液或 1:25 的 84 消毒液中，浸泡半小时,图四,缓冲间,缓冲间,缓冲间,缓冲间,缓冲间,样品制 备区,PCR 加样 区,PCR 扩 增及杂 交检测 区,2、 PCR 扩的注意事 A: B: 避,增及杂 交检测 区,样品制备区,PCR 加样区,PCR 扩增及杂交 检测区,样品制备及PCR 加样区,图一,图二,图三,走廊,PCR 扩增及 杂交检测区,PCR 加样区,样品制备区,2,3,以上后再行丢弃。如果有产物溅在了桌面或器具上，应立即用 1 mol/L HCl 溶液或 1:25 的 84 消毒液擦拭。 4、根据实验室情况建立完善的日常 PCR 防治制度并严格执行 事在人为，制度执行了才能达到它应有的效果，根据实验室实际情况建立制度后必须严 格执行，绝对不能因为图方便放松警惕。 五、PCR 污染后的处理 如果是器具的污染，可以对可疑器具用 1mol/L 盐酸或者 1:25 的 84 消毒液擦拭或浸泡。 如果台面污染，可能的话用紫外灯照射过夜。 如果是试剂污染请更换试剂，但试剂污染一般伴随着器具污染，务必查找出污染源并及 时处理。 对于被污染的区域，最好更换实验场所，可能的话应加装紫外灯照射过夜，实在不行也 必须加强通风几天，并停止实验后检测是否还有污染。 六、实验室实例： 1、分区情况： 实验室分成两个区，类似图二所示。因为条件所限，没有设置缓冲区，但两个区相隔较 远，可以有效避免汽溶胶的传播。 2、规章制度： A:定期监测：使用棉签涂抹的方法，一个月一次定期监测，监测地点为：超净台桌面、 超净台内枪（包括枪吸孔内和枪体）、超净台枪头盒、超净台内常用 PE 管架及 PCR 管架， 冰箱冰柜把手（两台）、冰箱内部（每个冰箱 3 个棉签包括冰箱内部表面和随机的冰箱内试 剂盒）、常用试剂试剂盒、试剂表面。抽提桌面、抽提区枪（包括枪吸孔和枪体）、抽提区常 用试管架、抽提区枪头盒、水浴锅水、沸水浴锅水，相关试验人员办公室桌面、鼠标、键盘。 需要做的工作：安排指定人员每月进行一次监测。每次监测填写记录表（见附表）。 B:物流： 严格单向物流，只允许从 A 区（样品制备及 PCR 加样区）到 B 区（PCR 扩增及杂交 检测区）的物品流动。 B 区任何物品(PCR 管架、PE 管架)进入 A 区前必须经过处理（1:100） 的 84 消毒液浸泡半小时）。各区物品单独使用，不允许交叉使用。 需要做的工作：A、物品 A-B 前处理(84 浸泡后洗涤) C:人流：抽提、PCR 以及 B 区必须要有单独的实验服，进入 A、B 两区进行实验必须穿上 各自的实验服，不允许将实验服穿到另一个区。（注：如果进入一个区不是为了实验，可以 不穿实验服，但绝对不允许穿另一个区的实验服进入）。实验服两周洗涤一次，但切记两个 区的衣服不要在同一批洗，分成两次洗，可以这周洗涤这个区的下周洗涤另一个区的。 需要做的工作：指定一周轮一周洗涤衣服，各人衣服各人负责。 D:实验规程：1、实验时必须戴橡胶手套或薄膜手套；抽提桌面实验完成后用 84 擦洗；PCR 实验室每天（实验量少的话可减少）晚上用紫外照射；如果在实验过程中发现有样品（包括 抽提前和抽提后）或 PCR 产物必须立即用 84 擦洗；在 B 区如果手接触过桌面或者其它有 可能污染有 PCR 产物的地方（枪、Luminex 仪器等）必须尽快洗手；定期处理：各区枪每 周用 1：25 的 84 消毒液擦洗（不需要拆开，主要是枪体和吸样孔内）。各区试管架每周用 1： 25 的 84 消毒液擦洗。各桌面每周用 1：25 的 84 消毒液擦洗。冰箱把手及外表每周用 1：25 的 84 消毒液擦洗。水浴锅及沸水浴锅每周换一次水。相关工作人员办公桌每周用 1：25 的,4,84 消毒液擦洗 需要做的工作： A、实验（特别是杂交检测），发现有产物溅出立即擦洗。 B、勤洗手。,C、PCR D、安排指定人员每周擦洗指定位置。 E、PCR 实验室做完实验打开紫外。 E:PCR 产物处理：准备保鲜袋，每次的 PCR 产物(包括杂交产物和 PCR 产物)丢弃前必须用 保鲜袋扎好后再丢弃；杂交检测试验区准备可以装保鲜袋并有盖子的垃圾桶，使用过的枪头 一律扎好后丢弃；电泳旁边的冰箱为 PCR 产物临时存放区，严禁 PCR 产物开盖存放，定期 (一个月)清理。 需要做的工作：A：严格操作，把 PCR 产物作为高危险物品小心处理。 B：指定日期清理 PCR 产物。 F:发生污染后的处理：如果怀疑有污染发生，执行监测程序，对于重点怀疑对象可以多作几 份。找到污染源后，桌面用 84 擦洗后紫外照射一个晚上，枪用 84 擦洗（拆开）后紫外 照射过夜，枪头盒、试管架84 擦洗后紫外照射过夜，枪头丢弃，试剂丢弃，衣物 用 84 浸泡后洗涤干净。冰箱把手84 擦洗后紫外照射过夜。冰箱内部84 擦洗如果污染严 重的话流水冲洗后 84 擦洗，试剂盒84 擦洗或流水冲洗。处理完后执行监测程序检查污染 情况。,试验日期,PCR 污染情况监测表 试验人员,5,试验方法：准备 1.5 ml EP 管，每管加入 500ul 的注射用水，取出一支干净的棉签，在 EP 管内浸湿后在目的地涂抹三次-五次，放回 EP 管内，挤压及转动棉签，确保棉签上可能的 污染物洗脱到管内液体中，丢弃棉签，盖上 EP 管盖作好标记。取样完成后按照常规 PCR 程序扩增、杂交检测。 日常工作安排表,6,