1,基因打靶 （Gene targeting） 郭长占 北京大学医学部免疫学系 E-mail: Tel.82805018 2008.11.3,2,(一)基因打靶的原理 基因打靶(gene targeting)是根据DNA同源重组的原理而设计的一项技术。在这一技术中，体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机整合而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点整合。,3,打靶载体(targeting vector)。,如何使外源基因能定点整合于靶基因上呢?根据DNA同源重组的原理，导入的外源基因必须和靶基因有一定的同源序列。因此，外源基因导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因称为打靶载体(targeting vector)。,4,基因打靶的结局有如下可能： (1)基因击入(gene knock-in) 在受体细胞基因组中定点引入一个完全新的基因。 (2)基因敲除(gene knock-out) 受体细胞内源靶基因被灭活,。 (3)基因替代(gene replacement) 靶基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的内源基因。,5,(二)基因打靶的方法： 进行基因打靶要经历以下步骤： （1）构建打靶载体。 （2）打靶载体导入受体细胞(常用胚胎干细胞(embryonic stem cell，即ES细胞)。 （3）打靶ES细胞导入囊胚。 （4）囊胚植入假孕母鼠子宫发育。,6,1. 打靶载体的构建： 基因打靶的关键在于构建打靶载体。在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段，这一片段称为同源重组指导序(homologous recombination directing sequences, HRDS)。外源基因插入这一同源序列之中。长度可从3kb至15kb。,7,通过同源重组将外源基因导入固定位点,从而有目的的突变内源基因，图中单线表示内含子，框图表示外显子,8,2. 外源基因导入靶细胞： 基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞(ES细胞)，ES细胞是一种多潜能的干细胞，能在体外传代而不改变其多潜能性。小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕3 5天)内细胞群分离的细胞。 1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman首先分离培养成功。,9,英国卡迪夫大学(Cardiff University)卡迪夫生命科学学院Martin J. Evans,10,外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法,11,外源基因导入ES细胞与否，还需经过G418和GANC培养基筛选。由于同源重组的频率很低，因而筛选并富集真正发生了同源重组的细胞是至关重要的。筛选可采用正负选择法。实现基因打靶的ES细胞能抵抗G418 而不能利用GANC。 G418 GANC,导入外源基因的阳性ES细胞的筛选,12,正负选择法的原理,在构建打靶载体时，打靶载体含有一段与靶基因同源的序列，将新霉素抗性基因(neor)插入到该同源序列的第一个外显子中作为正选择标（或者是靶基因最关键的外显子中）； neor可以抵抗G418.在同源序列之外的末端接上单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSVtk)基因序列作为负选择标志。HSV-tK可以利用GANC而导致细胞死亡。,1,2,3,Hsv-tk,neor,13,同源重组（基因打靶 Gene Targeting）,如果导入的外源基因与靶基因发生同源重组，外源基因以及neor基因将整合于靶细胞基因组的同源序列位点上，而位于同源序列末端外的HSV - tk基因则在重组后丢失，此种情况下标志基因只有neor基因表达，则靶细胞同时具有G418和GANC双重抗性可在选择性培养基中存活下来。,14,随机整合(Random Integration）,如果导入的外游基因与细胞基因组随机整合，打靶载体将从头至尾全部整合入靶细胞基因组中，这种情况下，标志基因neor、HSV tk同时表达。neor基因的产物使细胞具有G418抗性，而HSVtk基因的产物使细胞能利用GANC (Gancyclovir,丙氧鸟苷）而死亡。这样存活下来的细胞必定是发生了同源重组的细胞。,15,G418,GANC,16,打靶ES细胞的鉴定与扩增 筛选出G418R/GANCR的细胞克隆后再用PCR方法进一步鉴定，鉴定后的ES细胞克隆与囊胚体外共孵育或用显微注射的方法注入囊胚的胚泡中，再将囊胚植入假孕母鼠的子宫中发育。,17,18,3.基因打靶小鼠的繁育(breeding) 用基因打靶的方法产生的第一代子鼠为嵌合体(chimera)小鼠，即小鼠由囊胚的细胞及经基因打靶的ES细胞共同发育而来。因此并非小鼠的全部细胞中都整合有导入的外源基因。为获得纯合子的转基因小鼠，还需要用打靶后出生的雄性小鼠与提供囊胚的正常雌鼠交配，即回交(backcross)。回交后出生的子代鼠中有野生型的小鼠(-/-),即完全不携带有外源基因。也有杂合子的小鼠(-/+)。再用杂合子小鼠互交（intercross），从出生的子代鼠中可鉴定、筛选出纯合子的基因打靶小鼠。再经繁育可建立转基因小鼠品系，其实验流程见下图 。,19,20,(三) 组织特异性基因打靶 应用ES细胞和同源重组原理而发展起来的基因打靶技术使转基因动物的研究又向前迈进了一步，但仍有其局限性。主要问题是虽然通过基因打靶实现了外源基因在受体细胞基因组中的定点整合，但这种整合是没有组织特异性的，因此尚不能使外源基因仅在特定的组织中表达。Cre/loxP系统的发现及应用实现了外源基因的组织特异性表达。,21,loxP (locus of crossing over (x),P1)位点是由34对核苷酸为基本单位组成的DNA重复序列。来自P1噬菌体的Cre (causes recombination)重组酶可特异地识别loxP位点而使两个位点之间的DNA序列发生重组，其机制是Cre重组酶可在loxP位点中切开DNA序列而造成粘性末端。如果两个loxP位点 DNA序列方向相同(头一尾相对)，它们之间的DNA序列连同一个loxP位点被切除；如果两个loxP位点的DNA序列方向相反(头一头相对)，它们之间的DNA序列则被调转方向。,Loxp 位点,22,Cre,loxp,loxp,两个loxp位点之间的基因被切除,gene,23,两个loxp位点的方向相反,Cre,loxp,loxp,Gene,Gene,promoter,promoter,loxp,loxp,24,根据这一原理，在构建打靶载体时在靶基因同源DNA序列两侧引入loxP位点及选择性标志基因。然后按经典的基因打靶方法制备转基因小鼠。由于loxP位点不影响基因的表达，因此转基因小鼠体内除带有选择性标志基因外，其表型完全是正常的。只不过体内所有细胞靶基因两侧均含有loxP位点。,25,第二步是再构建另一种转基因小鼠，这种转基因小鼠能在特定的组织中表达Cre重组酶，方法是Cre重组酶基因要构建在特定的组织特异性启动子下游。如lck启动子只在发育中的T细胞中表达，将Cre重组酶基因构建在lck启动子下游，制备转基因小鼠。然后用这两种转基因小鼠杂交，后代中阳性重组鼠则仅在T细胞中表达Cre重组酶，Cre重组酶识别loxp位点便可实现仅在T细胞中的基因打靶。,26,27,(四)外源基因的时间可控性表达： 实现了组织特异性基因打靶后，导入的外源基因表达时间仍是无法控制的，因而仍无法确定外源基因的表达在动物发育不同阶段中的作用。另外，由于外源基因表达的时间不能控制，有时可造成转基因动物在胚胎期死亡。为了解决这一问题，Mentzger等人(1995)用编码Cre重组酶与人雌激素受体(estrogen receptor,ER)融合蛋白的基因制备了Cre ER转基因小鼠，给这种转基因小鼠注射人雌激素，可诱导Cre ER的大量表达。再用插入两个反向loxP序列之间的基因制备另一种基因打靶小鼠，并使该基因DNA序列与其上游的启动子方向相反，则该基因必须依赖Cre重组酶调转方向后方能表达。,28,29,例如，为了使导入的目的基因只在B细胞中表达，且表达的时间可以人为控制。可利用B细胞特有的CD19启动子控制Cre ER基因的启动，制备一个转基因小鼠。该转基因小鼠仅在B细胞中表达Cre ER基因,并且可用注射人雌激素控制表达的时间。 将目的基因插入两个loxP位点之间(两个loxP序列的方向相反)，制备一个基因打靶小鼠。该小鼠将依赖Cre重组酶将携带的外源基因调转方向后才能在B细胞中表达。用这两种转基因小鼠杂交，后代中阳性重组鼠则仅在B细胞中表达Cre基因，而且可以用注入人雌激素控制表达的时间。这样则可使目的基因仅在B细胞中被调转方向并表达，而且表达的时间也可人为控制，做到了转基因的组织特异性及时相可控性表达。,30,31,表1.用基因打靶法制备的一系列重要的基因敲除小鼠及表型8： 敲除基因 表现型 RAG-1和/或RAG-2 因无TcR基因重排而无T细胞 TcR 双阴性胸腺细胞聚集，双阳性胸腺细胞很少，TcR正常重排 TcR 有双阴和双阳T细胞而无单阳性T细胞 P56lck T细胞发育在早期双阳性成熟期受阻，无T细胞 CD3- T细胞发育在早期双阳性成熟期受阻 CD45 T细胞发育在双阳性成熟期受阻 MHC-,不变链 无CD4+T细胞，CD4+CD8-/+很少，正常NK，1.1+CD4+,CD8+正常 CD4 CD8+数量和功能正常 MHC-，2微球蛋白 无CD8+ T细胞，CD4+T细胞正常 TAP1/TAP2 TcR- 无T细胞，对结核杆菌易感性增加 P59fyn T细胞发育正常，T细胞应答缺损 IgM穿膜区 晚期CD43+B聚集，无等位基因排斥 5 CD43+细胞聚集，部分成熟B细胞出现延迟 IL2 IgG1, IgG2a，IgG2b自身抗体增加 CD40L 高IgM,无生发中心，低IL12和IFN，巨噬细胞活化受阻 CD28 IgG1，IgG2b减少,32,TcR基因敲除小鼠的表型,TcR 双阴性胸腺细胞聚集，双阳性胸腺细胞很少，TcR正常重排,33,基因敲除小鼠基因功能研究的有力工具。,34,转基因动物的维持,Duke University Laboratory Animal Resources Center,35,胚胎的冷冻保存,36,参考文献,郭长占. 转基因小鼠研究进展. 中华微生物学和免疫学杂志,2000,20(3):278-282. 杨晓 等. 基因打靶技术，科学出版社，北京. 2003.,37,国家遗传工程小鼠资源库,联系人：郭仕英 联系电话：025-58641520 Email: 网址： 地址：南京市浦口区学府路12号,38,美国实验动物公司,The Jackson Laboratory Telephone+1.207.288.5845 Fax+1.207.288.6150 Mail: The Jackson LaboratoryCustomer Service610 Main StreetBar Harbor, Maine04609-1500 U.S.A. Online:JAX Mice Online Order Request Form (secure interactive PDF) Email: orderquestjax.org,39,美国实验动物公司,Charles River Laboratories