人类基因组DNA提取、限制性核酸内切酶切割的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用,药学第二讨论小组,人类基因组DNA的提取,提取方法: 1从全血中提取 2从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取,(全血）原理：,细胞裂解液 ：裂解细胞膜，收集细胞核 SDS：破裂核膜 蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离 下来 苯酚氯仿：抽提去除蛋白质 无水乙醇：沉淀DNA 75%乙醇：洗涤DNA沉淀 真空干燥后，溶解于TE中即得到高分量的DNA,（全血）操作方法： 细胞裂解与RNase/蛋白酶K 消化 1. 取100 l抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 l裂解液和20 l RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。 2. 加入10l 3M的NaAc(pH 4.8)，随后加入1250 l结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm离心30秒。,DNA与吸附柱结合 3用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 注意：待转移上清约1300l，离心吸附柱容量约650 l，故需每次转移上清650 l到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。,DNA的纯化: 4. 再加入600 l洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 离心30秒。 5重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。 6小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 l洗脱缓冲液(elution buffer) 到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12，000 rpm 离心30秒。 7取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组NA。,（口腔上皮脱落细胞）原理 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA,除特殊要求外，白细胞，肝或脾组织是最常用的的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞，有时为了简易，还可以无创伤的采集材料，如用口腔上皮脱落细胞，发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞；,（口腔上皮脱落细胞）操作方法： 1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清液；重复1次。 2、沉淀中加1ml 1细胞核裂解液(STE)，打散细胞团、混匀，再加酶解混合液（含350l STE、150l 10% SDS和10l 20mg/ml蛋白酶K），摇匀，至出现粘稠透明状。37温箱过夜或5034小时。,3、加等体积饱和酚（或1/3体积的饱和NaCl），轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。 4、小心移上清至另一离心管（尽量避免吸取中间层），加等体积氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。 5、重复步骤4一次。,6、将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100l TE中。 7、TE溶解的DNA，在4下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70保存。,限制性核酸内切酶,一、概念,限制性核酸内切酶：,能识别双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸二酯键,二、分类,分类依据：酶的基因、蛋白质结构、依赖的辅助因子及与DNA结合和裂解的特异性,三、作用机制,以环状或线性的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核苷酸糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3-羟基和5-磷酸基的DNA片段。,四、切割方法,识别和切割位点 4-6个碱基对且具有回文序列的DNA片段 大多数酶是错位切割产生5或者3黏性末端 例如： EcoR I 切割后产生5黏性末端 5-GAATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5,黏性末端,平末端 有一些酶沿对称轴切断DNA，产生的末端称为平端或钝端 例如:SmaI,同工异源酶 来源不同的酶，但能识别和切割同一位点 如BamH I 和Bst I(GGATCC) 同尾酶 有些限制性内切酶识别序列不同，但是产生相 同的黏性末端。 如BamH I（GGATCC）和 Sau3A I(NGATCN),琼脂糖凝胶电泳结果分析,琼脂糖凝胶电泳结果分析,琼脂糖凝胶电泳结果分析,琼脂糖凝胶:天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些集团带有点荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。,什么是琼脂糖凝胶电泳？ 琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂凝胶分子筛作用，核算片段因其分子量或者分子形状不同，电泳速度有差异而分离。这种技术是基因操作的一种方法。,琼脂糖凝胶电泳原理,琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力,同时也由此造成了经过一定时间的泳动后按大小形成的一条“条带”。其中线状的DNA可以通过。,琼脂糖凝胶电泳原理:,核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离结果与核酸的分子量、分子构型和凝胶浓度密切相关。 实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比。通过比较标准物与未知片段的移动距离便可测出未知片段的大小。 但当DNA分子超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难讲它们分开。,1)核酸的分子量,质粒DNA有三种形式 1、共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在 2、开环DNA:质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子 3、线性DNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.,2）核酸构型,不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的质粒DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA。这三种构型的相对迁移速率主要取决于凝胶浓度，同时也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。,超螺旋DNA： 尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。 线性DNA： 当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速率介于超螺旋与切口质粒DNA之间。,开环DNA： 在质粒DNA复制过程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。,一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的电泳迁移率不同。要有效地分离大小不同的DNA片段，需选用适当的琼脂糖凝胶浓度。,3）琼脂糖的浓度,琼脂糖凝胶电泳的应用。,蛋白质和核酸，由于pH的不同带有不同电荷，且在电场中受力大小不同，导致发生泳动的速度不同，最终可将其分离开来。 电泳缓冲液的pH在69之间，离子强度0.020.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。,电泳的缓冲液中充满了离子，因此可以导电。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。,琼脂糖凝胶电泳注意点,选择合适的电泳方法 琼脂糖凝胶电泳：一般的核酸检测 聚丙烯酰胺凝胶电泳：高分辨率 脉冲凝胶电泳：DNA链巨大 凝胶浓度 浓度通常在0.52%之间，低浓度的用于大片段核酸的电泳，高浓度的用于小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意：高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。,缓冲液: 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。 注意：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。,电压和温度: 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15。 注意：如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象,DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计比较准确。需要注意的是Marker的电泳同样要符合DNA电泳的操作标准。,核酸染色剂,实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB） 溴化乙锭（EB）：是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射检测琼脂糖中的DNA 优点：染色效果好，操作方便 缺点：稳定性差，具有毒性。 注意：观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，会出现条带模糊的现象。,DNA样品的纯度和状态,样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。 乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。 变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。 用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性,DNA的上样 正确的DNA上样量是条带清晰的保证。 注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。,琼脂糖凝胶电泳操作步骤,1 制备琼脂糖凝胶 2.胶板制备 3.加样 4.电泳 5.漂洗 6.观察照相,琼脂糖凝胶电泳的应用,检测提取的DNA 设计完成引物，扩增好基因序列，做完PCR后，检测是否成功。 观察限制性内切酶的切割结果 通过切胶回收纯化某个片段,实验结果观察及记录,在波长为254nm的长波长紫外灯下，观察染色的或已加有EB的电泳胶板 记录下结果，找出实验中的问题及不足。,45,谢谢观赏,Office,Make Presentation much more fun,WPS官方微博 kingsoftwps,谢谢观赏,