脂质体的制备及包封率的测定,沈阳药科大学 药剂学教学实验中心,一、 实验目的 1、掌握薄膜分散法制备脂质体的工艺。 2、掌握用阳离子交换树脂测定脂质体包封率的方法。 3、熟悉脂质体形成原理，作用特点。 4、了解“主动载药” 与“被动载药” 的概念。,二、 实验原理 脂质体是由磷脂与(或不与)附加剂为骨架膜材制成的，具有双分子层结构的封闭囊状体。 常见的磷脂分子结构中有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。将适量的磷脂加至水或缓冲溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此相对缔和为双分子层，构成脂质体。,用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱等。常用的附加剂为胆固醇。胆固醇也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制得稳定的脂质体，其作用是调节双分子层的流动性，降低脂质体膜的通透性。其他附加剂有十八胺、磷脂酸等，这些附加剂能改变脂质体表面的电荷性质，从而改变脂质体的包封率、体内外稳定性、体内分布等其他相关参数。,脂质体的制备方法有多种，根据药物的性质或研究需要来进行选择。 (1)薄膜分散法 这是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声处理后得到小单室脂质体。此法优点是操作简便，脂质体结构典型，但包封率较低。 (2)注入法 有乙醚注入法和乙醇注入法等。“乙醇注入法”是将磷脂等膜材料溶于乙醇中，在搅拌下慢慢滴于55-65含药或不含药的水性介质中，蒸去乙醇，继续搅拌12h，即可形成脂质体。 （3）逆相蒸发法 系将磷脂等脂溶性成分溶于有机溶剂，如氯仿、二氯甲烷中，再按一定比例与含药的缓冲液混合、乳化，然后减压蒸去有机溶剂即可形成脂质体。该法适合于水溶性药物、大分子活性物质，如胰岛素等的脂质体制备，可提高包封率。 其他方法：冷冻干燥法 、熔融法 等。,在制备含药脂质体时，根据药物装载的机理不同，可分为“主动载药” 与“被动载药”两大类。所谓“主动载药”，即通过脂质体内外水相的不同离子或化合物梯度进行载药，主要有K+-Na+梯度和H+梯度(即pH梯度)等。传统上，人们采用最多的方法是“被动载药”法。所谓“被动载药”，即首先将药物溶于水相或有机相(脂溶性药物)中，然后按所选择的脂质体制备方法制备含药脂质体，其共同特点是：在装载过程中脂质体的内外水相或双分子层膜上的药物浓度基本一致，决定其包封率的因素为药物与磷脂膜的作用力、膜材的组成、脂质体的内水相体积、脂质体数目及药脂比(药物与磷脂膜材比)等。,对于脂溶性的、与磷脂膜亲和力高的药物，“被动载药”法较为适用。而对于两亲性药物，其油水分配系数受介质的pH值和离子强度的影响较大，包封条件的较小变化，就有可能使包封率有较大的变化，首选“主动载药” 方法。 下图为“主动载药”中pH梯度法载药原理示意图,H+,H+,D,D,DH+,DH+,inside acid pH,oudside neutral pH,评价脂质体质量的指标有粒径、粒径分布和包封率等。其中脂质体的包封率是衡量脂质体内在质量的一个重要指标。常见的包封率测定方法有分子筛法、超速离心法、超滤法等。本文采用阳离子交换树脂法测定包封率。“阳离子交换树脂法”是利用离子交换作用，将荷正电的未包入脂质体中的药物(即游离药物)，如本实验中的游离小檗碱，通过阳离子交换树脂吸附除去，包封于脂质体中的药物(如小檗碱)，由于脂质体荷负电荷，不能被阳离子交换树脂吸附，从而达到分离目的，用以测定包封率。示意图见下图。,Na+ SO-3,Na+ SO-3,Na+ SO-3,Na+ SO-3,Ber +,Ber +,Ber +,Ber +,Ber,三、 实验内容 （一） 实验材料与设备 1.实验材料：盐酸小檗碱、注射用大豆卵磷脂、胆固醇、无水乙醇、95乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、NaHCO3、阳离子交换树脂。 2.实验设备与仪器：旋转蒸发仪、烧瓶、恒温水浴锅、磁力搅拌器、吸耳球、光学显微镜、玻璃棉、5ml注射器筒、08 m微孔滤、紫外分光光度仪、溶量瓶等。,（二）实验部分 1空白脂质体的制备（用于测定柱分离度用） 【处方】 注射用大豆卵磷脂 0.9g 胆固醇 0.3g 无水乙醇 2-20m1 磷酸盐缓冲液 适量 制成约30m1脂质体,【制备】 （1）磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）0.37g与磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）2.0g,加蒸馏水适量，溶解并稀释至1000ml（pH约为5.7）。 （2）称取处方量磷脂、胆固醇于100ml（也可以是250ml、500ml或1000ml ）烧瓶中，加无水乙醇1-2ml（根据情况可以加10ml或20ml ），置于65-70水浴中，搅拌使溶解，于旋转蒸发仪上旋转，使磷脂的乙醇液在壁上成膜，减压除乙醇，制备磷脂膜。 （3）另取PBS 30ml于小烧杯中，同置于65-70水浴中，保温，待用。,（4）取预热的PBS 30ml，加至含有磷脂膜的烧瓶中，65-70水浴中搅拌水化10-20min。取出脂质体液体于烧杯中，置于磁力搅拌器上，室温下，搅拌30-60min，如果溶液体积减少，可补加水至30m1，混匀，即得。（整个过程也可在旋转蒸发仪上完成，其它的脂质体制备也可在旋转蒸发仪上完成。） （5）取样，在油镜下观察脂质体形态，画出所见脂质体结构，记录最多和最大的脂质体的粒径；随后将所得脂质体溶液通过0.8m微孔滤膜两遍，进行整粒，再于油镜下观察脂质体的形态，画出所见脂质体结构，记录最多和最大的脂质体粒径。,【注意事项】 (1)在整个实验过程中禁止用火。 (2)磷脂和胆固醇的乙醇溶液应澄清，不能在水浴中放置过长时间。磷脂和胆固醇的比例可以采用4：1或5：1或6：1，如果磷脂和胆固醇的质量不好，建议采用6：1 。 (3)磷脂、胆固醇形成的薄膜应尽量薄。 (4)60-65水浴中搅拌水化10-20min时，一定要充分保证所有脂质水化，不得存在脂质块。,2盐酸小檗碱脂质体的制备（被动载药法） 【处方】 注射用豆磷脂 0.6 g 胆固醇 0.2 g 无水乙醇 2-20m1 盐酸小檗碱溶液(1mgm1) 30ml 制成30ml脂质体,【制备】被动载药法 (1)盐酸小檗碱溶液的配制 称取适量的盐酸小檗碱溶液，用磷酸盐缓冲液配成 lmgml和3mgm1两种浓度的溶液。 (2)盐酸小檗碱脂质体的制备 按处方量称取豆磷脂、胆固醇置于100ml烧瓶中，加无水乙醇，余下操作除将PBS换成盐酸小檗碱溶液外，同“空白脂质体制备”，即得“被动载药法 ”制备的小檗碱脂质体。 【质量检查】观察粒子形态，最大粒径与最多粒径，药物的包封率。 【注意事项】同前。,3盐酸小檗碱脂质体的制备（主动载药法） 【空白脂质体处方】 注射用豆磷脂 0.9 g 胆固醇 0.3 g 无水乙醇 2-20 m1 柠檬酸缓冲液 30 ml 制成约30ml脂质体,【制备】主动载药法 （1）空白脂质体制备 称取磷脂0.9g和胆固醇0.3g，加入无水乙醇，置于65-70水浴中，搅拌使溶解，于旋转蒸发仪上旋转，使磷脂的乙醇液在壁上成膜，减压除乙醇。加入同温的柠檬酸缓冲液30ml，6570水浴中水化10-20min ，取出脂质体于烧杯中，余下操作同“1空白脂质体的制备” 。,（2）主动载药 准确量取空白脂质体2.0ml、药液(3mgm1) 1.0m1、NaHCO3溶液0.5m1，在振摇下依次加入10ml西林瓶中，混匀，盖上塞，70水浴中保温20min（定时摇动），随后立即用冷水降温，即得。 【注意事项】 (1) “主动载药”过程中，加药顺序一定不能颠倒，加三种液体时，随加随摇，确保混合均匀，保证体系中各部位的梯度一致。 (2)水浴保温时，应注意随时轻摇，只需保证体系均匀即可，无需剧烈振摇。 (3)用冷水冷却过程中，应轻摇。 【质量检查】观察粒子形态，最大粒径与最多粒径，药物的包封率。,【附注】 （1）柠檬酸缓冲液 称取柠檬酸10.5g和柠檬酸钠7g置于1000ml量瓶中，加水溶解并稀释至1000ml，混匀，即得。 （2）NaHCO3溶液 称取NaHCO3 50g，置于1000ml量瓶中，加水溶解并稀释至1000m1，混匀，即得。,4盐酸小檗碱脂质体包封率的测定 （1）阳离子交换树脂分离柱的制备 取已处理好的阳离子交换树脂适量，装于底部已垫有少量玻璃棉（或多孔垫片）的5ml注射器筒中（总量约4ml刻度处），加入PBS水化过的阳离子交换树脂，自然滴尽PBS，即得。 （2）柱分离度的考察 盐酸小檗碱与空白脂质体混合液的制备：精密量取3mgm1盐酸小檗碱溶液0.1ml，置小试管中，加入0.2ml空白脂质体，混匀，即得。,对照品溶液的制备：取中制得的混合液0.1ml置10ml量瓶中，加入95乙醇6ml，振摇使之溶解，再加PBS至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液4.0ml于10ml量瓶中，加PBS至刻度，摇匀，即得。 样品溶液的制备：取中制得的混合液0.1m1至分离柱顶部，待柱顶部的液体消失后，放置5min，仔细加入PBS(注意不能将柱顶部离子交换树脂冲散)，进行洗脱(约需2-3ml PBS)，同时收集洗脱液于10m1量瓶中，加入95乙醇6ml，振摇使之溶解，再加PBS至刻度，摇匀，过滤，弃取初滤液，取续滤液为样品溶液。 空白溶剂的配制：取乙醇(95) 30ml，置50m1量瓶中，加PBS至刻度，摇匀，即得。,吸收度的测定：以空白溶剂为对照，在345nm波长处分别测定样品溶液与对照品溶液的吸收度，计算柱分离度。分离度要求大于0.95。 柱分离度 = 1A样/（A对2.5） 式中，A样样品溶液的吸收度；A对对照品溶液的吸收度；2.5对照品溶液的稀释倍数。,注意：在进行柱分离度实验前，需要用空白脂质体对分离小柱进行饱和，具体操作如下：量取0.2ml空白脂质体，置于分离小柱顶部，待柱顶部的液体消失后，仔细用5mlPBS进行洗脱，待液体滴尽即可。,（3）包封率的测定 精密量取盐酸小檗碱脂质体0.lml两份，一份置10ml量瓶中，按柱分离度考察项下进行操作，另一份置于分离柱顶部，按 “柱分离度考察”项下进行操作，所得溶液于345nm波长处测定吸收度，按下式计算包封率。 包封率()=（ Al /At ）100 式中，Al通过分离柱后收集脂质体中盐酸小檗碱的吸收度；At盐酸小檗碱脂质体中总的药物吸收度， At = A样2.5 ，2.5为稀释倍数。,脂质体检测结果,五、思考题 1. 以脂质体作为药物载体的特点。请讨论影响脂质体形成的因素。 2. 从显微镜下的形态上看，“脂质体”、 “乳剂”及“微囊”有何差别？ 3. 如何提高脂质体对药物的包封率？ 4. 请问如何选择包封率的测定方法？本文所用的方法与“分子筛法”、“超速离心法”相比，有何优缺点？ 5. 请试着设计一个有关脂质体的实验方案？本实验方案还有哪些方面有待改进？,