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实验五质粒DNA的提取鉴定,掌握碱变性法从大肠杆菌中提取质粒DNA原理和方法。 掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。,一、实验目的,质粒(plasmid)是一种独立的稳定的遗传因子,存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的DNA分子,大小从1kb到200kb不等,具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的DNA基因信息,但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质,而宿主在没有质粒时是可以正常生长的。因此,质粒是一种寄生性的自主复制子。 细菌质粒是基因工程中常用的基因载体,也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。,二、实验原理,碱变性抽提法法是常用的方法之一. 此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。 在pH高达12.6的条件下,染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性;质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离,当用pH4.8的Kac高盐缓冲液调节pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,以可溶性状态存在于液相中,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的网状结构,与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。,二、实验原理,抽提中各种因素的影响,质粒DNA可能以三种形式存在: 1. 共价闭环DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA),常以超螺旋形式存在; 2. 开环DNA(open circular DNA,ocDNA),此种质 粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂,形成缺刻,可以自由旋转从而消除了张力,形成松弛的环状分子; 3. 线状DNA(linear DNA,lDNA),质粒DNA的两条 链在同一处断裂所形成。在电泳时,同一质粒DNA 的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环,线形 和超螺旋DNA。 cccDNA含量越高,表明制备的质粒DNA质量越好。,三、操作步骤 1.取2ml细菌培养液于2ml Eppendorf离心管中,4,5000rpm,离心5min, 弃上清(将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体尽可能流尽),保留菌体沉淀。 2.沉淀悬浮于100ul预冷的试剂(TEG缓冲液)中,混匀(置混合器振 荡),冰上置10min。 3.加入新配制的试剂(碱裂解液)200ul,加盖,轻轻颠倒34次,冰上置 10 min。 4.加入预冷的试剂(乙酸钾溶液)150ul,盖紧管盖,颠倒数次,冰上置10 min 。12000rpm,4,离心10min,以除去细胞碎片及大部分细菌染色体DNA。 5.上清液移入另一干净离心管中,加入等体积的平衡酚轻摇,12000rpm, 4,离心10min。 6.取上层水相置于另一离心管中,加入等体积的氯仿(氯仿:异戊醇=24:1) 抽提,12000rpm,4,离心10min。 7.取上层水相置于另一离心管中,加入2倍体积的预冷的无水乙醇,混匀后 置20过夜(至少要放置2h以上)。 8.12000rpm,4,离心10min,弃上清,将管口倒置于纸巾上使所有液体尽 可能流出。 9.加入1ml70%乙醇洗沉淀一次。12000rpm,4,离心10min。 10.弃上清,将管口倒置于纸巾上使液体流尽,放置干燥或真空干燥,即得质粒 DNA制品。 11.将沉淀溶于20ulTE缓冲液,(临用前加入1u 或20ug/ml RNaseA)待用。,50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-HCl 10 mM EDTA-Na2,200 mM NaOH 1% (W/V) SDS,3 M NaAC,省去,2,5 min,30 min 以上,实验步骤,不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同,在电泳时的泳动速率就不同,从而可以区分出不同的区带。 核酸构型不同,在凝胶中的电泳速度差别较大。同一质粒DNA的泳动速度次序为: 共价闭环DNA开环DNA线状DNA。 溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在波长254nm紫外光照射下插入溴化乙锭的DNA显橙红色荧光,所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。,四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理,1.琼脂糖凝胶的制备:本实验采用1.0%的琼脂糖凝胶。称取0.3g琼脂糖放入锥形瓶,加入30ml电泳缓冲液,置于微波炉使其充分融化。室温放置至60左右,加入EB使其终浓度为0.5ug/ml,混匀,倒胶板(30ml/板)。 2.凝胶板的制作: 用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两端边缘围成高4mm的墙,在其一端放置样品梳。将准备好的模板置于水平台上,迅速将上面 胶液倒在模板的中央,让胶液自 由流向四周。待胶液充分冷却凝 固,将胶纸围墙慢慢取下,制备 好的凝胶板放入电泳槽中,加电 泳缓冲液直至没过胶面约1mm深, 取出样品梳。,五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤,3. 加样:10 ul TE 溶解+ 4 ul 上样缓冲液,取10 ul点样 4. 电泳: 电压:120V 电泳时间:45 min 电泳终止:指示剂距离凝胶前沿约1cm处 5.检测:取出胶板,用紫外检测仪观察结果。纯的质粒DNA只有超螺旋DNA一条带。 6.凝胶处理:鉴定后的凝胶应放在指定的地方,待干燥后烧毁,不能倒在垃圾中,以防EB污染。,五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤,六、实验报告要求,一、 原理 二、 操作 三、 结果(铅笔绘图:正负极,条带数目、名称、强弱、距离) 四、 结果说明 五、 思考题 1、分离提取DNA的过程中哪些因素会引起链的断裂? 2、本实验为了质粒DNA纯度和分子的完整性,采用了哪些措施?,
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