鸡-防御素-1重组毕赤酵母的制备与表达,姓名：庄 杰 导师：张兴群,概述,-防御素是鸡体内的一种重要抗菌肽，除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外，它还参与机体免疫反应，如今由于抗生素的滥用引发的问题而日益引起人们广泛关注。 动物防御素具有代替传统抗生素的潜力，主要表现在：抗菌谱广，免疫原性无或低，对人畜无毒副作用，无残留，无耐药性，热稳定性和溶解性良好，对较高离子强度或较大pH变化耐受性较好。因此，防御素越来越受到研究人员的关注。,防御素,防御素是一类碱性阳离子抗菌肽，相对分子质量为3500-4500左右，分子中含有6-8个保守的半胱氨酸残基，形成3-4对分子内二硫键，并通过半胱氨酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的 -片状结构。根据其分子内半胱氨酸的位置和连接方式及前体性质的差异可分为 -防御素、-防御素、-防御素、昆虫防御素和植物防御素。防御素具有广谱抗微生物作用，包括各种细菌、真菌和一些具膜病毒，为机体抵御外界微生物侵袭的第一道屏障。,抗菌机理,防御素种类多种多样，抗菌谱也各不相同。不同的防御素的作用方式可能不同，同一种防御素与不同微生物作用时机理也可能不同。防御素的杀菌机理主要有以下几种： 1. 破坏细胞膜，形成离子通道 防御素可以通过电荷间的相互作用与细胞膜外层结构结合，其疏水部分在疏水作用和分子张力作用下，能够改变细胞膜的流动性和厚度，从而使细胞膜上出现孔洞，导致细胞质外渗或细胞外的物质进入到细胞内，严重时会引起细胞膜崩解，导致细胞死亡。,抗菌机理,2. 抑制胞外大分子的合成 防御素对肽聚糖、几丁质及一些生物大分子合成、交联的抑制也可能是其重要的杀菌机理之一。 3. 抑制胞内功能 防御素也能够破坏某些重要的胞内过程，从而促进细胞死亡。在某些实验中发现微生物能够在膜不完整的情况下存活更长的时间，这就预示着防御素可能有非膜破坏杀菌机制的存在。,抗病毒机理,防御素抑制和杀伤肿瘤细胞的机制与杀菌的机制不尽相同，它比杀菌机制更为复杂。一方面，它能通过其细胞毒性，主要是对细胞膜、核膜、线粒体、细胞核染色体和细胞骨架等的损伤来达到杀伤肿瘤细胞的效果；另一方面，防御素能通过调动机体免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌细胞的入侵。,防御素的应用现状,1 在医药行业的应用 细菌对传统抗生素的耐药性是当今全球性难题，防御素因其具有广谱的抗菌活性，独特的抗菌机理，并与典型的抗生素具有协同作用，能中和内毒素，调节机体免疫应答和炎症反应，调节组织创伤修复等特点引起了人们的广泛关注 2 在食品行业的应用 在食品方面，防御素主要用作防腐剂，防止食品腐败变质。,防御素的应用现状,3 在农业上的应用 防御素在农业中可用于农作物抗病育种。 4 在畜牧业上应用 防御素作为饲料添加剂对细菌具有很强的抑制作用，能够促经畜禽生长，提高饲料的利用率，动物在采食以后不会再体内残留。,酵母表达系统,酵母是目前研究比较成熟的一种表达系统，研究表明，防御素在酿酒酵母中的表达水平较低，而选用毕赤酵母则可获得高效表达，其表达水平高达70 mg/L，且重组肽具有与天然肽相似的二级结构和生物活性。,酵母表达系统,作为外源蛋白表达系统，毕赤酵母有其独特的优势：遗传操作简单；对重组蛋白可以进行翻译后加工修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；具有强有力的乙醇氧化酶(AOXI)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；对需氧生长有强的偏好，这一生理学特性使它能高密度发酵生长，表达量高，对工业放大生产有利；毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分离和纯化。,防御素毕赤酵母的构建及筛选,利用 TRNzol 试剂盒从安徽三黄鸡肝脏中抽提总 RNA，并进行电泳检测；根据 Genbank 中登录的鸡 -防御素-1基因序列，设计一对特异性引物，利用设计的引物扩增 Gal-1 成熟肽基因片段；将此片段与 pMD-18-T 载体相连，构建重组克隆载体pMD-18-Gal-1，转化大肠杆菌 DH5 后进行鉴定、序列测定；后将测序正确的目的片段与载体 pPIC3.5K 连接，构建重组表达质粒 pPIC3.5K-Gal-1，单酶切后用电转化的方法将构建的重组表达载体整合入毕赤酵母 GS115 中，然后进行了高拷贝的筛选和表型的鉴定。,高拷贝筛选,一般情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多，蛋白表达量就越高。pPIC3.5K 含有 neo 基因，赋予毕赤酵母 G418 抗性。而 G418 抗性水平主要依赖整合的 neo 基因的数目。单拷贝 pPIC3.5K 整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约0.25 mg/mL的 G418 抗性水平。因此可以通过 G418 抗性水平初步推断该克隆所包含的拷贝数。,高拷贝筛选,实验中使用浓度分别为0，50，100，200，300 g /mL的 G418 来进行高拷贝的初步筛选，然后进一步通过实时定量 PCR 来验证，两者结果基本一致。但也有研究发现高拷贝与高表达并不一定对应。因此，基因拷贝数对表达量的影响还无法预测，高表达菌株的筛选只应以表达蛋白量的高低作为唯一标准。因此还需要进行下一步的表达工作来证明高拷贝是否能提高重组 Gal-1 的表达量。,转化子表型的鉴定,外源蛋白在酵母基因组中的整合方式有两种：一种是在 His4 或5AOX1启动子区域，酵母染色体上的 AOX1 基因保持完整，这种整合产生的菌株表型为Mut+；另一种是双位点置换，含 5AOX1 启动子、外源基因和转录终止区的表达单元将染色体上的 AOX1 基因置换下来，导致 AOX1 基因的缺失，因而只能依靠弱转录的 AOX2 基因，所以利用甲醇速度慢，由此产生的菌株表型为Muts。,转化子表型的鉴定,基于此原理，我们对转化子进行了表型鉴定，方法是以5AOX1/ 3AOX1作为引物，酵母基因组作为模板进行 PCR 扩增。如果是 Mut+ 整合，可见两条带，一条与目的基因相关，另一条为 AOX1 基因（大小约为2.2 kb），如果是Muts整合，只有与目的基因相关的一条带。,重组酵母菌表达,培养基： 需要BMGY/BMMY(缓冲复合甘油或缓冲复合甲醇培养基)BMG/BMM(缓冲最小甘油或缓冲最小甲醇培养基)MGY/MM(最小甘油或最小甲醇培养基)进行表达。 BMG,BMM,BMGY,BMMY用于分泌蛋白表达，特别是当PH对蛋白活性比较重要时。它们是缓冲培养基，这与MGY、 MM不同。这四种培养基用磷酸盐缓冲，PH值在一个较大的范围内，可用于蛋白优化表达。酵母浸出物及蛋白胨作为“混合饲料”，使生长更好并可积累大量表达产物。,重组酵母菌表达,蛋白酶：有些蛋白特别易受在中性PH值时有很好活性的蛋白酶的影响。在这种情况下，建议用MGY，MM培养基，因为当毕赤酵母在无缓冲培养基如MM中表达时，PH降至3或更低，许多中性PH蛋白酶都将失活。毕赤酵母对低PH值有抗性，因此低PH值不会影响生长。 如果表达蛋白降解了，尝试在无缓冲培养基中进行表达。 如果以上条件仍不能有效防止蛋白降解，可将基因转入SMD1168 中，该菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相同，也可用于大规模发酵。,重组酵母菌表达,换气：毕赤酵母高效表达的重要因素是在甲醇诱导时充分换气。基本上在诱导时，培养基不要超过摇瓶体积的10-30%。建议使用隔板摇瓶，用2-3 层干酪包布或松散合适的盖子盖住摇瓶，不要用很紧的盖子。(换气在诱导前大量培养时并不那么重要) 温度及振荡：所有表达需在30度的摇床中进行。温度不能超过30度很重要，如果摇床温度不稳，设置在28度。使用落地式摇床，速度为225-250rpm，如果为台式摇床，速度调至250-300rpm。,重组酵母菌表达,开始前：先证实重组子及对照重组子(无插入，1拷贝插入)在GS115中的表达情况。进行表达时，选择合适的对照很重要，可以更好地解释你的表达结果。表达对照如下： GS115/ HIS+ Mut+ -gal Mut+胞内表达对照 GS115/HIS+ Muts Ablumin Muts 分泌表达对照 GS115/载体(无插入) 背景对照 GS115/载体(1拷贝插入) 单拷贝基因表达水平对照 不同的重组形式均会影响表达，建议挑取6-10个克隆进行表达水平筛选。,重组酵母菌表达,Mut+胞内表达：为检测表达条件是否有效，可培养GS115-gal (Mut+)(胞内表达-半乳糖苷酶)。亲代载体转化GS115作为胞内表达背景对照。 1 挑取单克隆，接种至25mlMGY，BMG或BMGY中，(250ml摇瓶)，28-30度，250-300rpm摇至OD600=2-6(对数生长，大约16-18小时) 2 室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用MM，BMM或BMMY重悬细胞至OD600=1.0，进行诱导表达(大约100-200ml) 3 在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。,重组酵母菌表达,4 每24小时，加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积。 5 在下列的各个时间点，取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。 6 用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，western blot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达(SDS-PAGEp47)。,重组酵母菌表达,Muts胞内表达:可培养GS115 Ablumin (Muts，分泌白蛋白至培养基中)检测培养条件的效率。记住要用转化亲本载体的GS115作为胞内表达的背景对照。 1 挑取单克隆，接种至含100mlMGY，BMG或BMGY的1L隔板摇瓶中。在摇床中28-30度，250-300rpm生长至OD600=2-6(约16-18小时) 2 室温1500-3000g离心5min 收集细胞，去除上清，用1/5-1/10原培养基体积的MM，BMM或BMMY重悬细胞(约10-20ml) 3 置于100ml隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住瓶口，放入摇床继续培养。,重组酵母菌表达,4 每隔24小时，加入甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。 5 在下列的各个时间点，取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。 6 用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，western blot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达。,重组酵母菌表达,SDS-PAGE分析： 任何标准SDS-PAGE仪器及程序均可用，如12%聚丙烯酰胺凝胶，5%浓缩胶用于分离40-100kDa蛋白。 样品准备：需要准备Breaking 缓冲液(P60)及酸洗0.5mm玻璃珠 细胞洗涤准备：(胞内或分泌表达) 1 快速融化细胞沉淀，置于冰上 2 每1ml样品，加入100ul裂解缓冲液(细胞+上清) 3 加入等量的酸洗玻璃珠(0.5mm)，通过置换来估算相等体积,重组酵母菌表达,4 涡旋30s，冰上孵育30s，重复8次 5 4度最大转速离心10min，将上清转移至干净的微量离心管中 6 取50ul上清(细胞裂解物)，加入50ul2SDS-PAGE凝胶上样缓冲液(样品buffer) 7 煮沸10min,每孔加10-20ul，依胶的厚薄及孔量，决定点样量。剩下样品存于-20度，用于western blot。细胞裂解物存于-80度用于分析。,重组酵母菌表达,如果没有表达或表达极低： 1 可以进行northern blot 分析或检查基因转录情况。 2 PCR分析插入情况。PCR选取12-20个转化子才可信，用空载体及单拷贝插入载