1,第二章 基因克隆所需的工具酶,2,3,一、限制性内切酶(restriction enzyme) 1限制性核酸内切酶的发现 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 根据1994年美国出版的分子生物学百科全书的统计数字，仅型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。 早在本世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制(restriction)和修饰(modification)系统。,4,5,在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制； 而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。,6,2核酸内切限制酶的类型,7,8,3核酸内切限制酶的命名法 由于发现了大量的限制酶，所以需要有一个统一的命名法。HOSmith和DNathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点： （1） 用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。,9,（2） 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如Ecok。 （3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。,10,（4）所有的限制酶，除了总的名称核酸内切限制酶R外，还带有系统的名称，例如核酸内切酶RHindIII。同样地，修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内切酶RHindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。 在实际应用上，这个命名体系已经作了进一步的简化： 由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。 在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，核酸内切酶的名称R便被省去。,11,12,4.型核酸限制性内切酶的基本特性,它具有三个基本特性： a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂； b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； c. 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。,13,a. 识别位点： 绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由48个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。,切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构，例如：,14,5-CTGCA G-3,5-CTGCA G-3,（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3OH的单链粘性末端，,3-G ACGTC-5， 3-G + ACGTC-5，,(b) EcoRI切割位点,切割后形成5-P的单链粘性末端，,5-G AATTC-3 5-G + AATTC-3,3-CTTAA G-5 3-CTTAA G-5,（c）EcoRV切割位点,切割后形成平末端。,5-GAT ATC-3 5-GAT + ATC-3,3-CTA TAG-5 3-CTA TAG-5,15,b. 切割类型： 检验了非常大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种独特的排列方式之一： （1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段； （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。,16,c. 产生的末端特征： 我们所说的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 平末端的DNA片段则不易于重新环化。,17,(2) 同裂酶 (isoschizomers) 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶(isoschizomers)。 同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如，限制酶Hpa和MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。,18,与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。 常用的BamH I, Bcl I, Bgl I,Xho I就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端，很显然，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。,(3) 同尾酶 (isocaudamer),19,由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”(hybrid site)。但必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如： Sal I（5-G TCGAC-3）和 Xho I(5-C TCGAG-3)的消化片段相连，但所形成的重组片段（5-GTCGAG-3）则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。但也有例外。,20,5影响核酸内切限制酶活性的因素 (1) DNA的纯度 核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。,21,为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法： 增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。 扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 延长酶催化反应的保温时间。,在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，因此在这种制剂中的DNA仍然是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后，DNA则会被DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。,22,(2) DNA的甲基化程度 核酸内切限制酶是原核生物限制修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。,23,(3) 酶切消化反应的温度 DNA消化反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。 不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37，但也有许多例外的情况，它们要求37以外的其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37，例如SmaI是25、ApaI是30；有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37，例如MaeI是45、Bcl I是50、MaelII是55；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达60以上，消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。,24,DNA的分子结构 DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。 此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差造成的。,25,(5) 核酸内切限制酶的缓冲液 核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。,对绝大多数限制酶来说，在pH=74的条件下，其功能最佳。,26,在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子。,有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的影响比较明显。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的情况下，是在G AATTC识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的甘油浓度超过5(VV)，那么其识别序列的特异性就会发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。,27,6. 限制性内切酶反应的终止 消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65温浴5分钟。 但有些酶，如BamHI和Hae对热稳定，则需加入终止反应液(如加入05molL的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L)螯合Mg2+，以终止反应。 此外，还可以用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。 如果用限制性内切酶消化DNA分子后，为了进行凝胶电泳分析，则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，直接上样进行凝胶电泳。,28,7. 利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤,29,限制酶消化反应的进行 以下是对0210 ugDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。 1) 将DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为18ul。 2) 加入2ul适当的10X限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混匀之。 3) 加入12单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之。 1单位酶通常定义为，在建议使用的缓冲液及温度下，在20u1反应液中反应1小时，使l ug DNA完全消化所需的酶量。,30,4) 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育。 5) 加入05molL EDTA(pH80)使终浓度达10mmolL，以终止反应。 6) 如果消化后DNA直接进行凝胶电泳分析，可加入6ul凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，即可加样进行电泳。 如欲纯化消化后的DNA，可用酚：氯仿和氯仿各抽提1次，再用乙醇沉淀DNA。,31,8. 使用限制酶的注意点 1） 限制酶十分昂贵!遵循以下建议可以最大限度地节省开支。为能从贮存管内取出小量的酶，只要用一次性使用的移液器吸头在酶溶液表面轻沾一下即可。这样，你可以取到少至01ul的酶。浓缩的限制酶也可在使用前用1X限制酶缓冲液稀释。但切勿用水稀释以免酶变性。 2) 限制酶在50甘油中保存于-20时是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即加以混匀，再从冰箱内取出贮酶管，立即放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头，一旦限制酶中污染了DNA或其他酶，将造成财力和时间上的浪费。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短。,32,3) 尽量减少反应中的加水量以使反应体积减到最小。但要确保酶体积