固定化酶与固定化细胞技术 王海磊 河南师范大学生命科学学院AEM室,2. 酶在应用中受到的限制因素：,1. 酶作为:生物催化剂的优点,稳定性差，易失活 反应速度随时间减慢（3分钟内吸光度的变化） 回收困难（淀粉酶水解废弃淀粉） 经济上不合算：多不能重复使用。 一些酶价格昂贵（漆酶用于木板粘合）,反应专一性强。 催化效率高（比一般催化剂高107-1013倍）。 反应条件温和（常温常压）。,（1）人工合成酶：应用化学合成法合成具有像酶那样活性的催化剂。这是有机合成和聚合化学中的最新技术。但距实际应用还有很大距离。 （2）酶的人工“改性”、“修饰”：酶和细胞固定化是其中的一类。其它如基因工程、化学修饰等方法。,3. 克服上述限制性因素的途径：,难得的报道：人工合成脂肪酶获得成功 随着生物产业的发展，人类对环境逐步认识，酶的广泛用途越来越得到人类的重视，尤其脂肪酶，在日化洗涤剂领域、医药美容领域、能源领域生物柴油生产中显得无可替代的优势。一般脂肪酶生产主要来源于发酵微生物生产法获得，产量受到限制，成本较高，很难满足工业需求。关于人工合成脂肪酶在中国乃至世界未曾有过相关报道。 经过不懈努力，我公司通过人工合成的手段获得成功，实属国际首例。经检验它不仅具备生物酶的通性，具有生物酶的全效功能，而且其催化性能、环境要求、毒化耐性各项指标远远高于普通生物酶。生产成本不足普通酶的三分之一，而且不受产量的局限，可大规模投入生产。 石家庄市华北联化科技有限公司,第一节 固定化酶 （Immobilized Enzyme）,一、发展概况,(1) 1916，Nelson和Griffin发现蔗糖酶结合于骨炭末上仍具有活力，但未引起人们重视。 (2) 1950前，研究不多，不超过10篇相关论文。有目的开展固定化研究始于50年代。1953，Grubhofer和Schloith将聚氨基聚苯乙烯树脂重氮化后与淀粉酶、蛋白酶结合最早固定化酶 (3)60年代进展较快：固定化酶投入工业化生产。 (4)70年代为快速发展时期。,固定化酶：连接于某种载体上或者限制在一定空间范围内、能连续使用的酶。,二、制备固定化酶的原则,1、保持酶原有专一性、高效催化能力和常温常压下起催化反应的特点。制备尽可能在温和条件下进行（低温、最适pH、水溶液中）。 2、能回收、贮藏和反复使用酶和载体结合牢固性问题。 3、有一定机械强度，以利于机械化、自动化操作。 4、酶与载体结合部位应避开活性中心及与维持酶高级结构有关的基团。且在制备过程尽可能保护这些基团。 5、最小的空间位阻：载体尽可能地不阻碍与底物的接近。 6、稳定性：载体不与底物、产物和反应液发生化学反应。 7、易与产物分离，便于回收和重复使用。 8、尽量降低成本。,三、固定化酶的制备方法,物理法: 吸附法、包埋法 化学法: 交联法、化学共价法 综合法: 逆胶束包囊法,（一）吸附法,采用固体吸附剂将酶吸附在它的表面使之固定的方法。,（1）无机吸附载体：矿物质和其它无机载体。 高岭土：胰凝乳蛋白酶 皂土： 过氧化氢酶、核糖核酸酶 氧化铝：葡萄糖氧化酶 二氧化硅（覆盖卵磷脂/脑磷脂）：酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖变位酶。 不锈钢：直径100-200粒子，以氧化钛处理，可吸附-半乳糖苷酶（17mg/g载体）。,1、载体类型,9,高岭土,性质：良好粘结性 粒度和细度 较强结合能力 离子吸附性及交换性,瓷土，现在世界上都把它叫做“高岭土”，在很久很久以前，高岭村有一家姓盛的穷苦夫妻，日子苦得就像黄连一样。 盛家夫妻心地却特别善良。有一年冬天，天气寒冷，屋檐下躺着个白发苍苍的老公公，盛家妻子端来了一碗热开水，送到那老公公跟前，请他喝下暖暖身子。妻子借来米，男人生火熬粥，一会儿工夫，一大碗香喷喷，热腾腾的米粥端到了老公公的面前。老公公见了，也不客气，一口气就把粥喝了下去。 我没有什么好报答你们，我走后，可到村后东南面的松山顶上一口气挖它个九九八十一锄，老公公早已不见踪影。 软乎乎得就像糯米粉一样：“松山顶上的石头，可以拿来做瓷器，做成的瓷器能跟玉器一样的值钱哩！” 将挖起的土石做成一个个碗和杯的坯子来，放进窑里一烧，果然个个晶莹洁白，真象玉器一样。 从此，高岭村的穷人们在盛家夫妻的带领下，改行挖土建窑烧瓷器了。松山因地处高岭，就改名叫高岭山，山上的瓷土，就叫做高岭土了。,10,皂土：膨润土、火山黏土。,皂土是由天然膨润土精制而成的无机矿物凝胶。膨润土一般是指主 要由蒙脱土组成的一种黏土岩。皂土的主要有效成分即为蒙脱土， 含量大约90%。,蒙脱石是由两个硅氧四面体夹一层铝氧八面体膨润土组成的2:1型晶体结构，由于蒙脱石晶胞形成的层状结构存在某些阳离子 如Cu、Mg、Na、K等,且这些阳离子与蒙脱石晶胞的作用很不牢 固，易被其它阳离子交换，故具有较好的离子交换性 。,（2）有机吸附载体 纤维素粉：糖苷水解酶 火棉胶：木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（70mg酶蛋白/ cm2） ),（3）离子交换剂作为吸附载体 CM-纤维素、DEAE（二乙胺基乙基）-纤维素、DEAE-葡聚糖。 人工合成的阴离子、阳离子交换树酯。由苯乙烯、二乙烯合成的聚合物。 阳离子型：磺酸、磷酸、-COOH、酚基等基团 阴离子型：季胺、仲胺、伯胺基团。,火棉胶： 硝化棉溶液；硝化纤维素：用一种天然胶或合成胶增塑的树脂与之相结合,通过溶剂蒸发而干燥后制成的材料。 对眼睛、呼吸道粘膜有刺激作用。经呼吸道和消化道进入人体，影响中枢神经系统。人接触后有咽喉痛、头痛、嗜睡、精神迟钝、腹痛、呕吐、皮肤及眼结膜充血、疼痛。本品极易燃。遇明火、高热、氧化剂或胺能引起燃烧爆炸。长期贮存能自燃。,CM-纤维素 CMcellulose 即羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose）为阳离子交换纤维素之一。,2、影响因素,pH：pH变化影响载体和酶蛋白的电荷，从而影响酶的吸附。一般在蛋白的等电点时可达最大吸附。 (2) 盐：影响复杂。一般会阻止吸附。实际上已被用来洗脱从低盐溶液吸附的酶。个别情况可促进蛋白的吸附于原来不吸附的惰性支持物上。 (3) 温度：随温度升高而增加吸附量。但酶失活会加速 (4)载体：与载体表面积、多孔度、载体预处理有关。颗粒越小则吸附越好。多孔载体与孔的大小和表面积有关。另外载体的预处理是极为重要的：有的载体会影响酶的结合量、有的会引起酶变性、有的会降低酶的活性。例如多孔硅，其表面有较高的酸性而易使酶变性，需要用缓冲液进行予处理。,3、吸附法优缺点,(1) 优点 操作简单;可充分选择不同电荷、不同形状的载体; 酶的纯化和固定化可在吸附过程中一步完成;酶使用过程的失活可重新活化;载体可再生 (2)缺点 pH、温度、离子强度、时间等多因素对固定化酶影响复杂，不同酶、不同载体的情况各不相同。 最适酶量的选择是经验性的。 吸附程度和固定化酶的活力间不一定平行。 酶与载体结合力不强，易导致催化力丧失和污染反应产物。,4、方法举例,酶的发酵生产 Aspergillus oryzae 3042扩大曲40-50小时发酵6倍冷蒸馏水抽提2次压滤酶液（亮黄色）测活力。（25M/小时/ml） 载体予处理：DEAE-sephadex 25溶胀0.05mol/L NaOH处理洗涤。 固定化：酶液调节pH7.0-7.0与载体混合（载体湿重：酶液=1g：60ml）4-7冷库搅拌吸附过夜吸去上清液用蒸馏水和0.15Mol/L醋酸钠水溶液洗涤水洗涤后4备用。,米曲霉氨基酰化酶,（二）共价结合法,在酶蛋白分子上功能团与固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接而使酶固定的方法。 固定化酶研究中最活跃的一大类方法,可供共价结合于载体的功能团包括： 氨基：N端-氨基、赖氨酸残基的-氨基 羧基：C端羧基、门冬-羧基、谷氨酸-COOH 巯基：半胱氨酸-SH 羟基：酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸的-OH 苯环：苯丙氨酸、酪氨酸 咪唑基：组氨酸 吲哚基：色氨酸,在进行一种酶的固定时，首先要考虑酶的氨基酸组成、活性中心的氨基酸、立体结构及专一化学修饰对酶活性和影响。实际上，共价偶联中最普遍使用的基团是：氨基、羧基、和苯环。 共价偶联反应应注意的问题： (1) 共价结合的功能基团不影响酶的催化活性。 (2) 反应尽可能温和 (3) 最好能在水溶液中进行 (4) 较高的反应专一性：只对某一类功能基团有很高的专一性，而对其它基团或才水溶液几乎无副反应。,载体选择时的注意问题： (1) 理化性质：应是亲水性质的，疏水载体往往对酶有变性的作用。 (2) 有尽能大的表面积：较细颗粒、多孔载体。 (3) 机械强度和稳定性 (4) 具备在温和条件下与酶结合的功能团。,常用载体： (1) 天然高分子材料：纤维素、琼脂糖、淀粉、葡聚糖凝胶、胶原及其衍生物。 (2)合成高聚物：尼龙、多聚氨基酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等。 (3)无机支持物：多孔玻璃、金属氧化物等。,按载体连接的基团类型分为： (1) 苯氨基载体 (2) 羧基载体 (3) 酯族氨基载体 (4) 硅烷化无机载体,载体表面获得反应基的反应类型 ： 苯氨基：重氮法、异硫氰酸法 羧基：叠氮法、酰氯法、活化酯法、酸酐法 羧基、氨基：缩合法 氨基：戊二醛活化法 含羟基化合物：溴化氰法 活泼卤素、二硫化合物、醛基高聚物：直接与酶偶联 其它：硅烷化法、金属鳌合法、四元缩合反应,1、重氮法,原理：带芳氨基侧链的聚合物用亚硝酸处理，形成重氮盐，在中性偏碱性条件处（pH8-9），亲电子的芳族重氮离子攻击活泼的芳香环，如酪氨酸的酚基、组氨酸的咪唑基，形成相应的偶氮衍生物。而与-NH2(N端-氨基、赖氨酸残基的-氨基)的反应，须在过量重氮盐存在下形成双偶氮化合物。,pH8-9,芳族重氮基具有疏水性，趋向于吸附蛋白分子上疏水性的酪氨酸集中区域。,重氮法常用的载体有： 带苯氨基的珠状聚丙烯酰胺 带苯氨基的多孔玻璃 间氨基苯甲氧基纤维素 对氨基苯纤维素。,ABSE-多糖（对氨基苯磺酰乙基 )制备过程：,例：ABSE-纤维素固定化胰蛋白酶,（1）碱性纤维素制备：24g干甘蔗芒杆纤维素，加48ml 12% NaOH溶液，0搅拌1h，15倍水稀释后过滤。 （2）活化剂配制：对-硫酸酯乙砜基苯胺24g，加60ml蒸馏水，40搅拌，加1mol/L Na2CO3溶液调节pH至6.5（约48ml），离心去沉淀，得到对-硫酸酯乙砜基苯胺溶液。 （3）ABSE纤维素制备：加碱性纤维素、活化剂溶液于反应器，热水浴保持温度达60，立即用0.5M NaOH调节至pH13,温度升至80,维持pH13保温45min。以2L 0.05M NaOH洗涤3次,再以水洗涤3次。得ABSE-纤维素（约75g）,（4）偶联酶： A. 配制酶液: 20mg胰蛋白酶溶于16ml0.05M CaCl2-0.03ml正丁胺(保护剂)混合液(预先以1M HCl调至pH9.5)； B. ABSE-纤维素处理：取5gABSE-纤维素，加10ml蒸馏水，冰水浴，边搅拌边加1M HCl、5%NaNO2各2.5ml，摇匀，冰浴15min抽滤，取出滤饼，迅速用预冷的0.05M HCl和蒸馏水各洗涤三次。(重氮化) C. 偶联：滤饼投入胰蛋白酶液中，立即用2M Tris液调pH至7.5-7.8，搅拌1h，抽滤。 D. 洗涤：固定化酶以50ml 3%NaCl搅拌洗涤3次，水洗涤2次后，悬浮于0.05M CaCl2溶液中，冰箱保存备用。,2、叠氮法,将载体上羧基活化成叠氮化合物，可以与酶分子上的-NH2、-OH、-SH发生共价结合。 这是最早、也是经常使用的一种共价结合的方法。 该类方法所使用的载体有：CM-纤维素、CM-Sephadex、聚门冬氨酸、生物胶CM-100等。,反应原理,即CM载体在酸或三氟化硼催化下以甲醇酯化，然后用水合肼肼解，再通过亚硝酸活化成叠氮化合物。可与酶-NH2基反应形成肽键而偶联（pH7.5-8.5，高聚叠氮化合物易结合-NH2基）。,3、溴