1,第十二章 微生物学新技术在环境工程中的应用,2,微生物学新技术包括：遗传诱变育种、基因工程、发酵工程、酶工程、微生物制剂、生物表面活性剂等。,3,12-1 固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用,4,一、酶制剂剂型,1、干燥粗酶制剂 将用麸曲或深层发酵的培养液除菌(或不除菌)后，与淀粉等惰性填料混合、干燥制成粗酶。,2、稀液体酶制剂 将培养液过滤除去菌体等杂质后，直接加稳定剂(甘油、乙醇、氯化钠等的复合物)和防腐剂作为商品出售。,3、浓液体酶制剂 将培养液除去菌体等杂质、浓缩后再加稳定剂和防腐剂制成商品。,5,4、干燥粉状酶制剂 我国多数生产此种酶制剂，其制备工艺为： 过滤培养液去菌体浓缩喷雾干燥研磨加稳定剂、惰性填料成商品 过滤培养液去菌体硫酸铵盐析或乙醇沉淀干燥研磨加稳定剂、惰性填料成商品 5、结晶酶 6、固定化酶 将酶和酶菌体固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，可较长时间使用。,6,二、酶的提取,1、预处理 不同的酶有不同的预处理方法： 胞外酶存在培养液中，只需将菌体过滤或离心除去，所得的清液即为粗酶液。如果是固态发酵麸曲，用水或缓冲液浸泡，再离心或过滤去菌体及杂物后所得清液即为粗酶液。粗酶液再经提纯即为酶精制品。 对胞内酶则要破碎细胞壁和质膜，制成无细胞提取液再提纯。 细胞破碎方法有：干燥法(空气干燥、真空冷冻干燥、溶剂脱水干燥)、机械法(研磨法、机械捣碎)、超声波破碎、反复冷冻法、自溶法、溶菌酶法。,7,2、酶的提取 (1)水溶液提取法：用稀的盐溶液、缓冲液或水提取。 (2)表面活性剂提取法 表面活性剂有：天然的胆酸盐、磷脂，合成的十二烷基硫(磺)酸钠(SDS,阴离子型)、二乙氨基十六烷基溴(阳离子型)、非离子型的有吐温(Tween)及三通X(triton-X)。,(3) 丁醇提取法,8,三、酶的纯化,1、浓缩 葡萄糖凝胶分子筛浓缩法、聚乙二醇(PEG)浓缩法、超滤膜浓缩法、冰冻法、盐析或乙醇沉淀后分离。,2、去杂质 pH沉淀法、利用蛋白质热变性的温度差异、蛋白沉淀剂法。,3、纯化 盐析法；有机溶剂沉淀法；层析法：吸附层析法、离子交换层析法、分子筛过滤层析(凝胶过滤层析)法、等电点沉淀法。,4、结晶 当酶达到一定纯度后，在适当的温度、pH条件下，逐渐加入硫酸铵溶液中，酶可慢慢析出结晶，也可加入某些有机溶剂析出结晶。,9,四、固定化酶和固定化微生物的固定化方法,(一) 固定化酶与固定化微生物,1、固定化酶 从筛选、培育获得的优良菌种体中提取活性极高的酶，再用包埋法(或交联法、载体结合法、逆胶束酶反应系统)等方法将酶固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，即。 2、固定化微生物 利用与固定化酶相同的方法将酶活力强的微生物体固定在载体上，即成。分死细胞固定化和生长细胞固定化2种。 微生物本身是多酶体系的固定化载体，将整个细胞固定化更有利于保持其原有活性，甚至可提高活性。 3、固定化酶与固定化微生物的特性 固定化酶与固定化微生物普遍比未固定化的微生物性能好，稳定、降解有机物能力强、耐毒、抗杂菌，耐冲击负荷。,10,(二) 固定化酶与固定化微生物的固定方法,固定化方法有载体结合法、交联法、包埋法和逆胶束酶反应系统。,1、载体结合法 以共价结合、离子结合和物理吸附等将酶固定在非水溶性载体上。载体有葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤维素等。 2、交联法 将酶与有两个或两个以上官能团的试剂反应形成共价键的固定方法。交联剂有：戊二醛、双重氮联苯胺和六甲撑二异氰酸酯。,11,3、包埋法 将酶包埋在凝胶微小格子(格子型)中，或将酶包裹在半透性的聚合物膜内(微型胶囊型)的固定方法。格子型的包埋材料：聚丙烯酰胺(PACAM)凝胶、聚乙烯醇(PVA)、琼脂、硅胶等。微胶囊型的包埋材料：尼龙、乙基纤维素和硝酸纤维素。 4、逆胶束酶反应系统 表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自发形成聚集体，其亲水性一端连接成逆胶束的极性核，水分子插入核中，其疏水性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子溶于逆胶束中，组成。,12,五、固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用,1、污染物处理 应用固定化酶或固定化细胞可以组成快速、高效、连续运行的污水处理系统。日本将淀粉酶固定后用于处理淀粉废水和造纸废水，效果较好。美国有人将多酚氧化酶固定后用于含酚废水处理，效果显著。德国将9种降解对硫磷农药的酶固定到多孔玻璃珠及硅胶珠上，再制成酶柱处理对硫磷废水，获得95以上的去除效果，连续运行2个多月酶活性基本不变。有人将白腐菌固定在海藻酸钙上对造纸黑液进行处理，脱色率高达80以上。,2、环境监测 根据固定化酶用于化学分析方面的相同原理，固定化酶也可用于测定有毒物质的含量，对环境进行监测。如固定化多酚氧化酶可用来测定水中的酚类物质。固定化酶可用于检测有机磷、有机氯农药、过氯酸盐、氰化物和尿素等。,13,12-2微生物细胞外多聚物的 开发与应用,14,微生物的胞外多聚物(Extracellular polymers，简写ECP)是微生物在一定的环境条件下，在其代谢过程中分泌的、包围在微生物细胞壁外的多聚化合物。包括荚膜、粘液层及其它表面物质。这些多聚物经分析得知其成分为脂、脂肽、多糖脂、中性类脂衍生物等。,微生物细胞外物质可作表面活性剂、絮凝剂或助凝剂、沉淀剂。,15,一、生物表面活性剂,1、表面活性剂是由亲水基和疏水基两部分组成的，具有影响不相容界面特性的物质。,2、生物表面活性剂(biosurfactant)：是生物在一定生长条件下，在其代谢过程中分泌产生的一些具有一定表面/界面活性的代谢产物。,16,3、分类,生物表面活性剂按用途可广义地分为生物表面活性剂和生物乳化剂(bioemulsifier)。前者是一些低分子量的小分子，能显著改变表面/界面张力。后者是一些生物大分子，并不能显著降低表面/界面张力，但对油/水界面表现出很强的亲和力。因而可使乳状液得以稳定。,17,(1)利用生物表面活性剂对油类的乳化作用，可将生物表面活性剂用于海上原油泄漏的生物降解与海岸石油污染的生物补救。 (2)生物表面活性剂对有毒有机化合物具有增溶作用，可用于土壤环境污染的生物修复。 Bacillus菌产生的一种生物表面活性剂能稳定地乳化杀虫剂肟(w)硫磷及其他不能与水混溶的液态有机磷杀虫剂。Pseudomonas cepacia能产生一种降解除草剂2,4,5,-三氯苯氧基乙酸的生物表面活性剂。 (3)另外，Mulligan和cooper认为生物表面活性剂能用于泥浆脱水。在采矿业和造纸业中，采用某些生物表面活性剂可稳定矿物的水悬浮液，以避免矿物的絮凝。国内有报道采用表面活性剂回收炼油厂废白土中的蜡和油，回收率可达93和95。 生物表面活性剂还可用于石油及能源工业、医疗领域、食品工业、化妆品工业等。,4、生物表面活性剂在环境工程中的应用,18,二、微生物絮凝剂,1、微生物絮凝剂：是利用生物技术，从微生物体内或分泌物中分离提取的一种安全、高效且能自然降解的新型水处理剂。它是由一类微生物产生的，可使液体中不易沉降的固体悬浮颗粒、固体细胞及胶体颗粒等凝聚、沉淀的特殊高分子代谢产物(次生代谢产物)。,2、微生物絮凝剂的主要成分是高分子有机物，包括糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等。其分子量多在105以上。,19,3、微生物絮凝剂的独特性质和特点 易于固液分离，沉淀物生成量少；无毒无害、安全性高，易被微生物降解；具有脱色和除浊性能；无二次污染；适用范围广；有的生物絮凝剂具有热稳定性强、用量小、不受pH条件影响等。,20,4、微生物絮凝剂的应用,(1)废水悬浮物的处理,(2)废水脱色处理,(3)乳浊液的油水分离,(4)污泥处理,(5)畜产废水处理,(6) 微生物絮凝剂在其它领域的应用,21,三、生物吸附剂,生物吸附是微生物菌体对重金属的吸附作用，包括细胞的不同部位对重金属的络合、螯合、离子交换、转化、吸收和无机微沉淀等。能够吸附重金属及其它污染物质的材料称生物吸附剂。,生物吸附剂主要分3类，即细菌、真菌和藻类。另外，壳聚糖也是一类重要的生物吸附剂。,22,12-3 优势菌种与生物制剂的开发与应用,23,筛选步骤：首先采集样品，尔后用稀释平板法分离出单个菌落，进行数次平板划线纯化，再将纯化的菌种接入斜面保存；进行菌种性能测定。取性能良好的菌种接入斜面，于4冰箱保存。或真空冷冻干燥保存；最后按废水、废物和废气的化学组分与需要量，合理搭配多种菌种。经扩大培养后用板框压滤，干燥，制成干活菌制剂。,24,微生物制剂可用于： 生物膜挂膜； 废水活性污泥法处理过程的添加剂，初沉池、曝气池均可投加，可提高废水处理效率； 有机固体废弃物堆肥的菌种和添加剂； 家庭便池、公厕的除臭剂； 禽畜粪便处理的菌种； 污染严重的河道进行生物修复，疏浚河道底泥； 降解和清除海面浮油和炼油厂的废弃物； 土地生物修复。,25,生物制剂的用法： 液体活菌剂直接使用；干的活菌制剂需用30左右的温水浸泡若干小时，使软化成浆状，加水调成含菌量为10710个/mL的菌液再投加。,