1,第二章 微生 物的 纯培 养和 显微 技术,2,培养物:在人为规定条件下培养,繁殖得到的微生物群体. 纯培养物-而具有一种微生物的培养物. 显微技术-显微标本的制作,观察,测定,分析及记录等.,自然环境如土壤和水中，通常栖息着的是许多不同微生物混杂在一起的群体。哪怕是一粒砂或尘土，也常含有多种细菌及其它微生物。,3,第一节 微生物的分离和纯培养,一. 无菌技术 培养物的纯洁 污染 自身/环境 1.微生物培养常用的器具及其灭菌 试管 玻璃烧瓶 培养皿 培养基,4,第一节 微生物的分离和纯培养,2.接种操作,5,二、用固体培养基获得纯培养,微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必须把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的培养。微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。纯培养的分离，是研究和利用微生物的第一步，是微生物工作中最重要的环节之一。 最常用的方法有涂布平板法、稀释倒平板法、平板划线法、 稀释摇管法等分离法等。,6,二、用固体培养基获得纯培养,涂布平板法-将已经熔化的培养基倒入无菌培养皿,制成无菌平板,冷却凝固后,将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用无菌涂布棒将菌液均匀的分散至整个平板表面,经培养后挑取单个菌落.,7,涂布平板法:,8,平板涂布分离法（Spread Plate）,简单易行，但易造成机械损伤,Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.,9,纯培养的分离方法,稀释倒平板法,10,稀释倒平板法,这是最常用的纯种分离法，先将待分离的材料作一系列的稀释(如1：10、1：100、1：1000、1：10，000)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至45的琼脂培养基相混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，平皿上就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。,11,12,稀释倒平板法分离微生物,13,平板划线法,将已熔化的培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，用接种环沾取少许待分离的材料，在培养基表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物将随着划线次数的增加而分散，经保温培养形成菌落。划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起。由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落。这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。用其他工具如弯形玻璃代替接种环，在培养基表面涂布，亦可得到同样结果。此法较为简便。,14,15,平板划线法分离微生物,16,平板划线分离法（Streak Plate）,特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）,An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.,17,稀释摇管法,先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热,使琼脂熔化后冷却并保持在500C左右,将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释,试管迅速摇动均匀,冷凝后,在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡混合物,将培养基和空气隔开.培养后,菌落形成在琼脂柱的中间.进行单菌落的挑取和移植,需要先用一灭菌针将液体石蜡-固体石蜡盖取出,再用一只毛吸管插入琼脂和管壁之间,吹入无菌无氧气体,将琼脂柱吸出,置放在培养皿中,用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植.,18,微生物纯培养分离方法的比较 涂布平板法:简单易行，但易造成机械损伤 稀释平板法 既可定性，又可定量，用途广泛 平板划线法 方法简便，多用于分离细菌 稀释摇管法局限于高度专业化的科学研究,19,Viable cell count,1.dilute sample,1 ml,9 ml,10 100 1000 104 105 106 107,cell no/ml,2. plate out 0.1 ml,20,Inoculating an agar plate to obtain single colonies,21,Mixed culture,Pure culture,22,Mixed culture,Oral swab,Swab from sole of shoe,23,Each colony was examined microscopically,24,三、用液体培养基获得纯培养,个体大的细菌 原生动物 藻类 稀释法-接种物在液体培养基中进行顺序稀释,以得到高度稀释效果,使一只试管中分配不到一个微生物.如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物.如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了,得到的纯培养物的概率就会下降.,25,液体稀释法,26,四. 单细胞挑取法分离,这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上，把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取，再接种到培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。,27,单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,28,五. 利用选择培养基分离法,不同微生物需要不同的营养物质。有些微生物生长适于酸性环境，有些则适于碱性环境。各种微生物对不同的化学试剂如消毒剂(酚)、染料(结晶紫等)、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。利用这些特性，便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。另外，也可以将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。对一些生理类型比较特殊的微生物，为了提高分离机率，往往在涂布分离前先进行富集培养，其目的是提供一个特别设计的培养环境，以帮助所需的特殊生理类型的微生物的生长，而不利于其他类型微生物的生长。,29,选择性培养分离法,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离 富集培养,30,选择培养基分离法,1.dilute sample,1 ml,9 ml,10 100 1000 104 105 106 107,31,细菌在固体培养基中的生长情况,32,细菌在液体培养基中的生长情况,33,细菌在半固体培养基中的生长情况,34,六. 微生物的保藏技术,通过分离纯化得到的微生物纯培养物,必须通过保藏技术使其在一定时间内不死亡,不会被其他微生物污染,不会因发生变异而丢失重要的生物学性状,否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行. 生物的生长一般都需要一定的水分,适宜的温度和合适的营养,微生物也不例外.菌种保藏就是根据菌种的特性及保藏目的的不同,给微生物菌株以特定的条件,使其存活而得以延续. 例如:培养基或宿主菌株连续移种 改变环境条件-干燥,低温.缺氧.避光,缺乏营养 使菌株的代谢水平降低,乃至完全停止.半休眠. 休眠.,35,六. 微生物的保藏技术,菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。,菌种保藏的目的,菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持 其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死 亡、不变异、不被污染，以达到便于研 究、交换和使用等诸方面的需要。,36,菌种保藏的原理,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。,其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。,尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株,37,菌种保藏方法,各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。,38,斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法,39,1. 斜面低温保藏法常用保藏法,将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续不断。,此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏 此法的主要保藏措施是低温。一般可保存16 个月左右。 优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点 是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期 短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污 染。,40,2. 石蜡油封藏法,此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体 石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物） 上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝， 加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4冰箱内 保藏。,此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保 存12年左右。,41,3. 砂土管保藏法,一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的 微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的 细菌及酵母则不适用。,砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等 诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物 移接方便，经济简便。它的保藏期约110年。,该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121蒸汽灭菌11.5h，间歇灭菌3次。50烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约24h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4冰箱内保藏。,42,4. 麸皮保藏法,又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然 后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水 以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经 冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将 试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干 燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔 封，再保藏，则效果更好。,此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏 期在1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较 多采用。,43,5. 甘油悬液保藏法,此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用20，保藏期约为0.51年，而采用70，保藏期可达10年。,将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在1015，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。 基因工程菌常采用本法保藏。,44,6. 冷冻真空干燥保藏法,又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，