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1,第三章核酸化学,Nucleic Acid chemistry,2,核酸是一类重要的生物大分子,担负着生命信息的储存与传递。 核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域,是基因工程操作的核心分子。,核酸概述,3,第一节 核酸是遗传物质的载体,一、核酸的研究发现史 1868年,F. Miescher从细胞核中分离得到一种含磷量很高酸性物质,即现在被称为核酸的物质。,4,1928年,F. Griffith的转换转化实验,or,and,可分离,5,1952年, Hershey、Chase T2噬菌体:32P和35S分别标记核酸和蛋白 1953年,Watson、Crick DNA双螺旋模型 1981年,Cech 核酶(Ribozyme),6,98核中(染色体中) 真核 线粒体(mDNA) 核外 叶绿体(ctDNA) DNA 拟核 原核 核外:质粒(plasmid) 病毒:DNA病毒,二、核酸的种类和分布,核酸分为两大类: 脱氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid (DNA) 核糖核酸 ribonucleic acid(RNA),7,RNA主要存在于细胞质中,tRNA (transfer RNA) rRNA (ribosomal RNA)(真核与原核的区别) mRNA (messeger RNA) (真核与原核的区别) 其它 RNA病毒:SARS、TSV,三、分子生物学的中心法则,8,第二节 核酸的基本化学组成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,元素组成: C H O N P,核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖(核糖或脱氧核糖)和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖,一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外,还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。,9,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2-脱氧核糖;RNA所含的糖则为-D-核糖。,一、戊糖,10,二、碱基,1. 嘌呤碱(Purine bases),11,2. 嘧啶碱(Pyrimidine bases),CH3,12,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多,大部分是上述碱基的甲基化产物。,13,三、核苷(nucleoside),核苷 戊糖+碱基 (糖苷 P19) 糖与碱基之间的C-N键,称为C-N糖苷键,14,假尿苷() 次黄苷(肌苷)I 黄嘌呤核苷 X 二氢尿嘧啶核苷 DHU 取代核苷的表示方式 7-甲基鸟苷 m7G,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,15,四、核苷酸(nucleotide) 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,16,五、核苷酸衍生物,1. 继续磷酸化,17,2.环化磷酸化,cAMP,cGMP,3. 辅酶 NAD、NADP、FAD,18,六、多聚核苷酸(核酸),多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,19,20,5-磷酸端(常用5-P表示);3-羟基端(常用3-OH表示) 多聚核苷酸链具有方向性,当表示一个多聚核苷酸链时,必须注明它的方向是53或是35。 注意:核苷酸链的方向与二酯键的方向相反,多聚核苷酸的表示方式:1.竖线式:P4822.文字式:,DNA RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,21,第三节 DNA的结构,一、DNA的一级结构 脱氧核糖核酸的排列顺序 可以用碱基排列顺序表示 连接键:3,5-磷酸二酯键 磷酸与戊糖依次相连形成主链骨架 碱基形成侧链 多核苷酸链均有5-末端和3-末端 DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,22,2. 基因与基因组,基因(gene):一段有功能的DNA片段,生物细胞中DNA分子的最小功能单位(交换单位)。,23,基因组(genome):某生物体(完整单倍体)所含全部遗传物质的总和。 包括:核基因组(拟核/核DNA)及核外(质粒DNA),各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小,24,3. 原核生物基因组特点 重复序列少,多位编码区 多为操纵子形式组织 有重叠基因存在,真核生物基因组特点 以染色体存在 重复序列多,基因组计划 人类基因组计划(Human Genome Project, HGP ): 19902002 酵母基因组计划 (YGP):1989-1996 大肠杆菌(E.Coli):1997,25,negative control,26,二、DNA的二级结构,(一) Chargaff 规律 1950年,(1)所有生物的DNA中,A=T,G=C,A+C=G+T, 且A+G=C+T。 (2) DNA的碱基组成具有种的特异性。 (3) DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。 (4) 年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。,27,(二) DNA的双螺旋模型,1953年,J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基础上,根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型,提出了著名的DNA双螺旋结构模型,并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。 在DNA分子中,嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,28,DNA双螺旋模型要点,B型结构 a. 两条链反向平行,右手螺旋; b. 碱基在内(AT,GC),碱 基平面垂直于螺旋轴, 戊糖环在外,平行于螺轴; c. 双螺旋每转一周为10碱基对(bp),上 升3.4nm; d. 氢键维系两链的结合; e. 碱基自由排列。,29,(1)B-DNA:典型的Watson-Crick双螺旋DNA 右手双螺旋 每圈螺旋10.4个碱基对 螺距:3.22nm (2) A-DNA 右手双螺旋,外形粗短。 RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。 (3)Z-DNA 左手螺旋,外形细长。 天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。,30,双螺旋DNA的结构参数,稳定双螺旋的力 氢键 碱基堆积力(疏水相互作用及范德华力) 离子键等 则:DNA变性剂(热、pH、脲/酰胺、有机溶剂),31,三股螺旋DNA K. Hoogsteen 1963,通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合: oligo(Py) : oligo(Pu)oligo(Py/Pu) 第一股是寡嘧啶,中间是寡嘌呤,第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤,32,第三股与寡嘌呤之间同向平行,并按Hoogsteen配对。,T= A : A , CG : C+ T = A : T CG : G,33,DNA的存在形式,34,二、DNA的三级结构,DNA三级结构:指DNA双螺旋的进一步扭曲与折叠形成的特定构象,包括三方面内容(P490) 原核 双链环状DNA(dcDNA) 病毒 单链环状DNA(scDNA) 单链线性DNA(ssDNA) 负超螺旋 几个参数: 连环数:指双链的互绕数,L(linking number) 扭转数:指螺旋圈数,T(twisting number) 超螺旋数:即缠绕数,W(writhing number) L = T + W 拓扑异构酶:I(L01)、II( L0-2 ),35,36,真核 双链线性DNA(dsDNA):P495,37,38,第四节 RNA的结构与功能,一、结构特点 碱基组成 A、G、C、U (AU/GC) 稀有碱基较多,稳定性较差,易水解 多为单链结构,少数局部形成螺旋 分子较小 分类 mRNA(hnRNA 核不均一RNA) tRNA rRNA (snRNA/asRNA) 少数RNA病毒,39,二、tRNA,占RNA总量的15 一种氨基酸对应最少一种tRNA,分子量25000左右,大约由7090个核苷酸组成。 分子中含有较多的修饰成分。 3-末端都具有CpCpAOH的结构。 三叶草形(二级结构):1个臂、4个环,40,tRNA的三级结构,41,42,三、rRNA,占RNA总量的80,43,四、mRNA和hnRNA,占细胞总RNA的35,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA),称为 “尾结构” ,5 -末端有一个甲基化的鸟苷酸,称为 “帽结构 ” 。P484,五、snRNA (small nucleic RNA 核小RNA) scRNA (small cytoplasmic RNA) asRNA (antisense RNA),44,第五节 核酸的性质,45,二、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中,由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系,因而具有独特的紫外线吸收光谱,一般在260nm左右有最大吸收峰,可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 以A260/A280进行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭(EB),在紫外下发出荧光,46,三、核酸的变性、复性与分子杂交,1. 变性 稳定核酸双螺旋次级键断裂,空间结构破坏,变成单链结构的过程。核酸的一级结构(碱基顺序)保持不变。 变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加(增色效应) 变性因素 pH(11.3或5.0) 变性剂(脲、甲酰胺、甲醛) 低离子强度 加热,47,DNA的变性过程是突变性的,它在很窄的温度区间内完成。因此,通常将加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称熔解温度或熔点,用Tm表示。 一般DNA的Tm值在82-95C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关,也与DNA的均一性和介质中离子强度有关。 G和C的含量高,Tm值高。因而测定Tm值,可反映DNA分子中G, C含量,可通过经验公式计算:(G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,2. 热变性和Tm,48,3. 核酸的复性,变性核酸的互补链在适当的条件下,重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 DNA复性后,一系列性质将得到恢复,但是生物活性一般只能得到部分的恢复,具有减色效应。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时,DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性,因此又称为“退火”。 退火温度Tm25 复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性(重复序列数目)/ 溶液离子强度,49,4.分子杂交,DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 Southern 杂交(Southern bloting) Northern 杂交(Northern bloting) Western 杂交 (Western bloting),50,51,引物,引物,* 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 * 引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性。,3,5,5,5,5. PCR技术,基因组,52,PCR原理图,3,3,3,变性、退火,延伸,变性、退火、延伸,3,53,四、核酸的序列测定,双脱氧链终止法(Sanger酶法),54,本 章 小 结,核酸是遗传物质载体的证明和研究历史 核酸的化学结构:戊糖、碱基(A、T、G、C、U),核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点(原子编号) DNA的结构:一级结构(核酸序列及其表示、基因及基因组、序列测定)、二级结构( Watson Crick双螺旋模型、ZDNA)、结构维持的化学键 RNA结构与功能:碱基组成特点、RNA的种类结构及功能
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