毕业论文文献综述食品质量与安全组胺降解菌株鉴定方法概述摘要：本文根据微生物的普遍鉴定方法，概述了组胺降解菌的的形态特征鉴定方法，生理生化鉴定方法与分子鉴定中的应用16S rRNA和16S rDNA的细菌鉴定方法。关键词：组胺；生理生化；分子鉴定0前言由于组胺中毒事件发生频率较高，每次涉及的人数较多，且一些冷冻产品和加工制品被检出组胺含量超标的案例不断上升，所以世界各国对组胺的相关研究一直是近年来水产品行业的研究热点之一。目前，我国的相关研究大多集中在组胺的检测方法的探索以及与组胺相关的鲭鱼中毒的流行性病学报道。比如范青霞、曾艳、李青等分别报道了近年来因食用鲭科鱼类而产生的中毒案例1-3。另有10多篇文献报道了不同的组胺分析检测方法，如分光光度法、高效液相色谱法，等离子色谱法等4-7，这些研究主要涉及罐头、鱼粉等不同样品。而国外对组胺的相关研究要进行的深入且全面，包括组胺的萃取、分离、检测分析以及形成机理等各个方面8-10。相比较而言，各国对组胺的控制降解技术的研究，特别是工业化的脱组胺工艺的研究各国还较为薄弱。组胺一经产生，就很难去除，从而造成巨大经济损失与安全隐患。为防止食物中毒以及经济损失应该从组胺这一源头抓起，所以，组胺降解技术暨微生物降解技术的研究对社会经济与食品安全发展有重大意义。本文根据微生物鉴定通用检测方法，将其运用到组胺降解菌株的鉴定中，综述了组胺降解菌株的几种鉴定方法。1形态观察11121.1 显微观察将适量菌株在载玻片上进行涂布，并令其自然干燥， 然后手执载玻片一侧，标本面朝上，在火焰外侧往复3-4次， 待冷却后滴加结晶紫染液，使整个标本固定在染色液中。染色1-3 min后，在显微镜观察菌体的形态。1.2 革兰氏染色 在干净载玻片上，用接种环挑取少许菌种，于载玻片上无菌水滴边缘涂片，待自然风干后，在火焰外侧往复3-4次，待冷却后滴加结晶紫染液染色lmin，然后用水冲净结晶紫液。滴加碘液冲净残水，并覆盖约lmin。用水冲去碘液，将片上的水甩干。滴加 95%乙醇液脱色约20-30s，并立即用水冲净乙醇。再用蕃红液染1-2min之后洗净蕃红，待玻片风干后用显微镜油镜观察涂片。1.3 芽孢染色取培养24h左右的菌株进行涂片、干燥和固定，然后滴加3-5滴孔雀绿染液于己固定的涂片上。用木夹夹住载玻片在火焰上加热（使染液冒蒸汽但勿使沸腾）。加热时间从冒蒸汽时开始计时约4-5min。倾去染液，待载玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。再用蕃红水溶液复染lmin，水洗。待干燥后，置油镜观察。2生理生化鉴定711122.1 糖酵解试验在无菌操作下，用接种针或环移取菌种少许，接种于葡萄糖发酵液体培养基管中，并在361条件下培养。每天观察培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡（微小气泡亦为产气阳性）。2.2 淀粉水解试验以培养1824h的菌株，涂布接种于淀粉琼脂斜面上，在361培养条件下培养2448h。将碘试剂滴在培养表面上，立即检验结果。若为阳性反应（淀粉被水解），则琼脂培养基呈深蓝色、菌落周围出现无色透明环；若为阴性反应（淀粉未水解），则菌落周围没有透明环。2.3 VP试验将菌株接种于VP试验培养基中，在361培养条件下培养4-6 d。取培养液(约2mL)和等量的40 % NaOH溶液混合，加入少量(约0.5-1 mg )肌酸，摇动2-5 min。阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361恒温箱中，若2h内仍不显现红色，则为阴性。2.4 甲基红（Methyl Red）试验 将菌株接种于通用培养基，培养于361环境中3-5天。从第二天起，每日取培养液1mL，加甲基红指示剂1-2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色（目前发现阳性或至第5天仍为阴性即可判定试验结果）。2.5 靛基质（Imdole）试验将菌株接种于试验培养基管中，在361条件下培养24h，取约2mL培养液，加入Kovacs氏试剂2-3滴，轻摇试管，呈红色为阳性。2.6 硝酸盐（Nitrate）还原试验在试验前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（-萘胺乙醇溶液）试液各0.2mL等量混合，取混合试剂约0.1mL，加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性；若无红色可再加一滴二苯胺试剂，如呈蓝色则无硝酸盐还原作用，否则按硝酸盐还原阳性处理。2.7 明胶（Gelatin）液化试验将菌接种于明胶明胶高层约2/3深度或点种于平板养基中，在20-22条件下培养7-14d。再放入4冰箱中，观察培养基还能不能凝固，若不能凝固，则明胶被液化，呈阳性；能凝固即明胶未被液化，呈阴性。2.8 尿素酶（Urease）试验 将培养18-24h的菌种大量接种于液体培养基管中并摇匀，在361条件下分别培养10，60和120min，并观察结果。若呈粉红色，则为阳性；若显阴性应继续培养4天，然后作最终判定，变为粉红色为阳性，反之为阴性。3分子鉴定14-273.1 16S rRNA测序技术按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取目的菌株的基因组DNA，然后在PCR反应体系内进行PCR扩增。目的基因经回收纯化后，进行测序。获得的16S rRNA序列在NCBI上用BLAST软件与GenBank数据库序列进行对比与同源性比较。3.2 16S rDNA序列分析法 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取目的菌株的基因组DNA，然后在PCR反应体系内进行PCR扩增。将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，进行测序。获得的16S rDNA序列在NCBI上用BLAST软件与GenBank数据库序列进行对比与同源性比较。4小结近年来对微生物的研究技术在快速、微量、精确的程度上越来越优越。我们在运用不同鉴定方法的同时，不能单一运用一种或片面的鉴定方法，要将微生物的培养条件、镜检特征、生理生化和分子鉴定相结合，才能完整的说明该类微生物的生物学特征。这样，我们的研究才会更有意义，科学的发展才更严谨与快速。参考文献1 范青霞,孔亚明,马洪喜.一起因食用鲭鱼引起的组胺过敏慢性食物中毒J.医学动物防制,2006,22(4):295-296.2 曾艳,周朝虹.58例扁舵鲣鱼所致组胺中毒的急救J.中国热带医学,2009,(04):704-705.3 李青.一起变质鲐鱼引起组胺中毒的调查分析J.中国社区医师(综合版),2007,(23):259.4 赵新颖,焦霞,夏敏等.离子色谱法同时测定水源水中的五种生物胺J.色谱,2009,27(4): 505-508.5 朱文慧,周德庆.分光光度法测定鱼罐头中组胺的方法改进J.食品科学, 2008,(1):223-225,229.6 黄新华,陈本美,梁绍先,等.高效液相色谱法测定生物组织中的组胺J.分析化学简报,2000, 28(7): 865-867.7 陶志华,佐藤实.海水中组胺菌的分离及其理化性质分析J.生物技术, 2009,19(1):42-44.8 Driouich R. , Takayanagi T., Oshima M. ,etc. Separation and determination of n-alkylamines and histamine bycapillary zone electrophoresis using salicylaldehyde-5-sulfonate as aderivatizing reagentJ. Journal of Chromatography A, 2001(93):495103.9 Lopez-Sabater E. I. , Rodriguez-Jeres J.J., Hernadez-Herrero m.,etc. Incidence of histamine-forming bacteria and histamine content in scombroid fish species from retail markets in the Barcelona areaJ. International Journal of Food Microbiology , 1996,(28): 411-418.10 Kuda T. , Mihara T., Yano T. Detection of histamine and histamine-related bacteria in Wsh-nukazuke,a salted and fermented Wsh with rice-bran, by simple colorimetric microplate assayJ. Food Control, 2007(18): 677681.11 沈萍,陈向东.微生物学实验（第4版）M.高等教育出版社,2007.12 R. E. 布坎南N. E. 吉本斯.伯杰细菌鉴定手册（第8版）M .北京:科学出版社,1984 :760 - 790.13 龙雯,陈存社.16S rRNA测序在细菌菌种鉴定中的应用J.北京工商大学学报（自然科学版）,2006,24(5):10-12.14 李鹏,马艳娇,赵云.16S rRNA、23S rRNA及16S23S rRNA基因在细菌分离与鉴定中的应用J.现代畜牧兽医,2008,7:49-51.15 宋维娟,程池.PCR-SSCP技术在假丝酵母属菌种鉴别中的应用J.微生物学通报,2009,36(6):918-922.16 满朝新,迟涛,胡博韬等.rep-PCR指纹图谱技术在乳酸菌鉴定中的应用J.中国乳品工业,2010,38(5):4-6.17 张根生,李大龙,李志等.哈尔滨风干肠中优势蛋白质降解菌筛选及16S rDNA鉴定J.食品科学,2010,31(1):186-188.18 张彤,方汉平.微生物分子生态技术：16S rRNA/DNA方法J.微生物学通报,2003,30(2):97-99.19 刘文海,邓先余,向言词等.一株甲胺磷高效降解菌巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的分离及其分子鉴定J.海洋与湖沼,2009,40(2):171-172.20 苏乾莲,黄维义,张为宇等.奶牛温氏支原体16S rRNA基因的PCR扩增、克隆及分析J.中国兽医寄生虫病,2008,16(60:1-5.21 Xiaoyang Zhi, Lingling Yang, Yun Wang, ect.Genus-specific PCR for molecular identification of novel isolates of the genus NesterenkoniaJ.Acta Microbiologica Sinica,2008,48(5):644-645.22 Kuda T. , Mihara T.Reduction of histamine in fish sauces by rice bran nukaJ. Food Control, 2010,21(10): 13221326.23 Jose LB, Ignacio B, Imanol RZ, et al. Sequencing of variable regions of the 16S rRNA gene for identification of lactic acid bacteria isolated from the int