! 收稿日期!#$%? ABCDDE:+*;=2 山羊骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞诱导分化 张晓强 !李 旭!吴 涛!黎健伟!杜 浩!裴国献 南方医科大学南方医院创伤骨科!广东 广州($(# ?广州市儿童医院骨科!广东 广州 ($ 摘要!目的 探讨体外分离$培养山羊骨髓间充质干细胞%FGHIJ(?!NO25P胰岛素$+;(?!NQ25?转铁蛋白$($? !2=5Q25抗坏血酸$?2=5QR地塞米松及$?NQ25?STL9/$ :(-0HN=3XPY=CP23DD=cP2CJC8E235PJXC2PC55Jh P8=eD=EXCPB8C=XEBCJh P4e.X4=P3ePe4AACDCX43X4=h PX4JJ.CP CN4CCD4N PP材料与方法 fP实验动物及主要试剂%仪器 $月龄健康中国青山羊体质量*PjN由南方 医院实验动物中心提供) 低$ 高糖MG1G培养基$ LFH%E5=CP 代的789):接种于79高糖 4838培养基#!过夜! P79冲洗!滴加/00#生物素标记的抗山羊G?E#孵育 /#%OC!P79冲洗! 辣根酶标记链霉卵白素孵育/# %OC!467显色!中性树胶封固!光学显微镜下观察$ K;L6?HI$JC细胞免疫荧光%方法同上!加入/00稀 释的兔抗人一抗!荧光显微镜下观察并拍照$ /1!1;#789):诱导后逆转录F聚合酶链反应分别在 诱导0周的时间点! 倾倒孔板中的培养液! P79冲洗后每!孔细胞加入/#%A#5HORBA! 按GCSOTHB?IC 公司5HORBA说明书提取总UV6!)BAAJ?IC#GG#引物序 列% 上游55)6E)565EE6E65E6)665)! 下游 6E6E5)56E6E5E6)5E6E! 扩增片段长度为 ;!#WX6?HI$JC引物序列% 上游E6E65EE6EEE# 5E6EE5)!下游6)E)5E)5)EEE)55)!扩增片 段长度为;0#WX FJ$TOC#引物序列%上游%6EE55EE)5)5E6)5E5! 下游%5)5)55665E5)6)E)6)E$ U5和P)U步骤按常规进行$ 反应条件为%Y;#! 预变性#%OC 然后执行#!变性;0#:! 退火0#%OC左右!紫外灯下观察$ 将电泳凝胶置 于ZGD73U#D*U865凝 胶 成 像 系 统 !G%J?I#PHB# XA:#10分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字 化!以目的基因灰度值内参基因灰度值表示%UV6 相对含量$ 重复L膜并使其活化在 PZ4膜下放/层滤纸! 然后将胶平铺于PZ4膜 上!盖上/层同样滤纸!剪得大小完全一致!用玻璃棒 除去各层间气泡胶面向阴极!膜面向阳极#!0#Z电 转0#%OC杂交%取出PZ4膜!将其浸入封闭液!;# !过夜5795洗膜#%OC#00兔抗人6?HI$JC一抗稀释度 为/;00(FJ$TOC蛋白步骤同上!浓度为/000);#! 摇床孵育过夜5795洗膜#%OC#.+,即 可达到Y0=融合K图/7L# 流式细胞术检测细胞表面 抗原!可见表达789):标志物)4!Y!而不表达传代 造血干细胞标志物)4&;K图/)!0* 图!山羊#$%=1 ()*+,-./0123+1,45675189:12;2+6 3+;2/24+72.?#)*+,A./812+6 5B45675188A8-89+3- +A35921 87 983. :;=1 ? B22C1 37.2 56,D.85 .8 677225.3.2 .8B361 DA85684-31.1 ()H1.B81I+72.#)$241.4.08 :B81I+72.9:12;2+63+;2/24+72.? ( # 图J成软骨诱导G周细胞化学染色 9$E =*.8+A2(+3- 1.3559 87 .A2 :;=1 ? B22C1 37.2 56,+.85 .8 677225.3.2 .8B361 +A85684-31.1 ()(624+B6587+22;9:12;2+63+;2/24+72.?#)K.652C28B6587+22; 9:12;2+63+;2/24+72.?8LL2335.4,7.4M83271,9:12;2+6 3+;2/24+72.?*)(;184+2335./65.1848489:12;2+63+;2/24+72.? (# ;184+免 疫荧光可见有阳性表达G#=周时呈强阳性表达9图 J8LL和 (;184+%图=8LL3OR(在未诱导时未能 检测到表达随着诱导时间的增加表达量逐渐升高 第J期 张晓强S等N山羊骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞诱导分化=G!( 图!各时间点#$% 5/ .*)*-/ /8* (,-/+ +01901:758 :77777779777777A77777!777777177777+7777777777777B777777C 77 D+ECF7 !777777B777777C 77 77 !H5%$6结果!图 诱导9$A$!周后可检测到软骨特异性的*型胶 原和+,(#!9有促进软骨细胞 特异性细胞外基质沉积的作用G(%地塞米松有抑制向 脂肪细胞分化的作用%胰岛素在促进细胞分裂和糖原 合成中具有重要作用% 地塞米松和胰岛素通过与 YD4;!9的协同作用来促进1VBP向软骨细胞分 化Z(%转铁蛋白可携带离子进行跨膜转运J(%维生素B 可使细胞分泌的基质和胶原纤维有机地组成与排列# 同时也可抑制或减少凋亡的产生9:(%它们都在促进山 羊1VBP向软骨细胞的分化中起到了一定的作用!9$ ?A7#-%7胰岛素$?A!#-%7转铁蛋白$1VBP作为软骨组织 !下转!AG页 777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777南方医科大学学报T7V$M6O1(LO_)IUOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO第AJ卷 /$6OI)LM#(LOOOOO9ON(2OOOOOOOOAON(2POOOOOOO!ON(2P !AA) !上接!页 工程种子细胞的可行性#表明其是一种有潜力的软骨 组织工程种子细胞来源$对于如何将其用于构建软骨 组织修复软骨缺损#进行体内软骨缺损的修复#尚需 进一步研究$ 参考文献! %$,-()781 %!型骨质疏松山羊骨髓基质细胞体外 成脂成骨分化的研究%D&;,科学技术与工程5,NNO5POQ$RJ,KKM!LM; %K,中国青山羊胫骨骨缺损模型的研究 %D&;,中华创伤骨科杂志5,NN$5,KQKRJ,FLKN; %! %HPPaC:0P 4+A+P9A)+13 PDPg+A=PY(C5P NN$5P$EG!IJPMKFL!E; %FP9A)+*() P 6 %EP8fEP(f=+(CCPf=P9(:PY(C5PNNN5PHHGIJPKMLK; %$NPP 9APY()P?P=MP P6+(0CP90)1(+PY(C5PNN!5POGHIJPYON$LM; %!P9(:5PNNM5P$FGIJPF$LE!; %HP%+*)CP90)1(+5PNNO5P$NMGOIJPOOFLMH; %OP%$U4.$j9a%$PPg)1:PY(=5PNNH5P$KGOIJP$KEL!; %$P丙戊酸钠抑制i_PON细胞增殖并诱 导其凋亡与分化%D&;P中国实验血液学杂志5PNNO5P$!G$IJP$L!; %$P+(0B()P?PB3(:3C=:0CP6:5PNN!5P$N!GHIJP$OOLE; %$KP-6gPD5PNN$5PNG!IJPOEOELMF; %$!P_(2(B ! 第K期李益清5等;丙戊酸对i_LONji细胞%M&=$P%$MN表达水平及耐药性的影响!M(