基因的定点突变,基因定点突变,一、定点突变的发展史 二、定点突变的目的 三、定点突变的原理 四、体外定点突变的方法 五、定点突变的方法改进 六、定位突变用途 七、应用前景,一、定点突变的发展史,1983年，世界上第一株转基因植株(zambryski，1983)的获得标志着植物转基因时代的到来。 1984年，Paszkowski将NP皿I等嵌合基因克隆到E.coh质粒上，并用PEG转化烟草获得成功。 1985年，Horsch等创立了农杆菌介导的叶盘法转基因系统，大大简化了以往利用原生质体为受体的转基因体系，具有里程碑的意义。 1987年，Frommetal转化CAT基因，获得成功。1987年，Jcffersontal利用GUS作为报告基因，使转基因愈伤组织和植株检测变为方便快速，大大的提高转基因效率。1987年，美国康耐尔大学的Sanford等发明了基因枪。,1988年，ein首次将其用于植物转基因研究，克服了当时农杆菌介导的转基因方法的受体种类和基因型的限制，开创了植物转基因方法的新领域。McCabeetal利用基因枪法转化大豆幼胚和成熟胚的下胚轴获得了转基因再生植株。 1990年，From示etal利用基因枪法成功转化T玉米胚性愈伤组织。同年Fine:andMcmullen(1990)用陆地棉柯字310的胚性悬浮系进行的基因枪转化。获得了10个再生植株，较农杆菌介导的遗传转化，所用的再生时间较短(5个月)。其后，MeCabeandM inell报道T基因型独立的基因枪转化方法。 1994年，Hieital通过使用农杆菌侵染诱导剂乙酞丁香酮(AS)以及构建巧rG和巧rB高效表达的超双元载体，高效成功地转化了水稻。利用该转基因系统，Ishidaetal(1996)、Tingayetal(1997)和Chengetal(1997)相继获得了玉米、大麦和小麦的转基因植株。,二、定点突变的目的,基因定点的突变是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重排等变异。 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工具。 蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定碱基进行定点改变，缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构和功能，改造酶的不同活性或者动力学特性。,三、定点突变的原理,定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。,四、体外定点突变的方法,（1）寡核苷酸介导的定点突变 （2）PCR介导的定点突变 （3）盒式突变,（1）寡核苷酸介导的定点突变,寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家( michael smith )发明的.,寡核苷酸定点突变基本原理,合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因完全互补。 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型子代链。 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中基因已被定向修改,（2）PCR介导的定点突变,在最初所建立的PCR方法中就可看出只要引物带有错配碱基便可使PCR产物的末端引入突变。但是诱变部分并不总在DNA的中间部分进行诱变。 目前采用重组PCR进行定位诱变，可以在DNA片段的任意部位产生定位突变。,（3）盒式突变,1985年Wells提出的一种基因修饰技术盒式突变。 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入限制位点。,五、定点突变的方法改进,设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。,有的时候研究可能需要多个位点的定点突变，比如改造酶的活性或者动力学特性，研究蛋白之间的相互作用位点等，单点突变不能满足实验的需要，重复进行单点突变也非常浪费时间。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。最多一次实验可以引入5个定点突变。这个试剂盒的原理和Clontech的相似，就是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，DpnI消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。,资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有12个不同定点突变的质粒（因为存在12个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。这样，一次实验可以得到不同数目突变的质粒，对于研究蛋白质结构和功能的关系也是有用的。,六、定位突变用途,定点突变法的应用不仅广泛用于基因工程技术领域，还可用于农业培育抗虫、抗病的良种，用于医学矫正遗传病、治疗癌症等病。 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。,七、应用前景,不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人熟悉应用。,在分子生物学和基因工程中的应用,探明未知序列的结构和功能的关系，如启动子诱变筛选，真 核的TATA盒保守序列确定。 载体构建：调控元件，强启动子，多接头。 研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。,在蛋白质工程中的应用,降低毒性，如TNF 改变亚型和种的特异性，如IFN的23位AAG（赖氨酸），AGG（精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123位Try（酪）变甘/丝，使IFN种属特异性明显改变，对人抗病毒活性小于牛。 提高活性和稳定性，如IFN- ser17（cys变ser） 提高蛋白质作用的专一性，如IFN的9-56位被IFNa的7-54位取代后，活性提高40倍。,谢谢观看！,个人观点供参考，欢迎讨论,