第三节 外植体的选择与培养,一、外植体的选择：,种质优良,植株健壮,取材的最适时期,适宜的大小,选材,第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术,二、外植体灭菌,1：对材料进行预处理 2：材料表面灭菌： 1）水洗,滤纸吸干; 2)70%酒精浸3060s; 3）用灭菌剂处理; 4）用无菌水冲洗.,第三节 外植体的选择与培养,表面灭菌剂的种类较多，可选取12种使用。,常用灭菌剂使用浓度及效果比较表,第三节 外植体的选择与培养,三、外植体的接种与培养,（一）接种无菌操作 定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到无菌培养基上，这一过程叫做接种。,第三节 外植体的选择与培养,(1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； (2)接种前15-20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷雾降尘，并擦拭工作台面； (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。,第三节 外植体的选择与培养,接种前的准备工作：,(1)对接种材料进行消毒； (2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒精火焰上方转动，灼烧数秒钟； (3)用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入或放在培养基表面； (4)接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟； (5)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； (6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染； (7)接种完毕后要清理干净并用70%酒精擦工作台。,第三节 外植体的选择与培养,接种时的无菌操作技术：,（二） 外植体培养,外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。,第三节 外植体的选择与培养,培养的环境条件:,第三节 外植体的选择与培养,定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做继代培养。,第三节 外植体的选择与培养,四、外植体成苗途径,1、外植体愈伤组织根、芽试管苗 同时长芽和根 先长芽，再长根 先长根，再长芽 2、外植体胚状体试管苗（胚状体途径） 3、外植体根、芽试管苗（器官发生途径）,第三节 外植体的选择与培养,外植体,愈伤组织,胚状体,芽、根,根、芽,芽,芽,根,根,试管苗,外植体成苗途径：,第三节 外植体的选择与培养,B,A,C,(1)、直接从器官上发生(2)、从愈伤组织发生(3)、从游离的单细胞发生(4)、从小孢子发生,(1)数量多 (2)速度快 (3)结构完整,第三节 外植体的选择与培养,胚状体的产生途径：,诱导胚状体比诱导芽的优点：,五、培养过程中常出现的问题 及解决方法,第三节 外植体的选择与培养,污染,褐变,玻璃化现象,组织培养三大难题,第三节 外植体的选择与培养,1、污染原因 细菌污染 真菌污染,（一）污染,真菌污染,2、污染的预防措施,第三节 外植体的选择与培养,(1)减少或防止材料带菌(2)外植体灭菌要彻底(3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌(4)布质制品的灭菌(5)无菌室的消毒(6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。,1、定义： 是指外植体在培养中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响材料的培养。,第三节 外植体的选择与培养,（二）、外植体的褐变,植物品种 生理状态 培养基成分 培养条件不当,第三节 外植体的选择与培养,2、褐变的主要原因,选择合适的外植体： 合适的培养条件： 连续转移 加抗氧化剂： 加活性炭,第三节 外植体的选择与培养,3、减轻褐变现象发生的措施,（三）玻璃化现象,1、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为玻璃化。,第三节 外植体的选择与培养,2、玻璃化现象产生的原因,细胞分裂素浓度较高时； 琼脂浓度低时； 温度低、光照时间长时； 气体交换不良时； 培养基中无机离子种类及比例不当时。,第三节 外植体的选择与培养,适当控制培养基中无机营养成分； 适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度； 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素量； 增加自然光照，控制光照时间； 降低培养温度，进行变温培养； 增加容器通风，最好进行CO2施肥。,第三节 外植体的选择与培养,3、预防措施：,第四节、试管苗驯化与移栽,第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术,试管苗,草莓,1、试管苗的生态环境： 高温且恒温、 高湿、 弱光、 无菌,一、试管苗的特点,第四节、试管苗驯化与移栽,百合试管苗,(1)生长细弱； (2)光合作用差 (3)叶片气孔数目少，活性差 (4)根的吸收功能弱 (5)对逆境的适应和抵抗能力差,第四节、试管苗驯化与移栽,小麦试管苗,2、特点：(与常规苗相比）,二、炼苗（驯化）,驯化的目的： 通过减肥、增光、降温、控水等措施，提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合作用的能力，提高试管苗的移栽成活率。,第四节、试管苗驯化与移栽,三、试管苗的移栽,1、直接移栽法 2、常规移栽法 3、嫁接移栽法,第四节、试管苗驯化与移栽,（一）移栽方法：,四、提高试管苗移栽成活率的途径,1、试管苗的生理状况：移栽壮苗 2、植物生长调节物质：适当加入生长素，去除细胞分裂素，有利生根，提高成活率 3、无机盐浓度：适当降低 4、加入少许活性炭 5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子 6、使试管苗从无菌向有菌逐渐过渡,第四节、试管苗驯化与移栽,本章小结：,(1) 常用的培养基：MS培养基；B5培养基；White培养基；N6培养基；KM-8P培养基。 (2) 水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成培养基的五种主要成分。 (3) 配制母液。即先配成大量元素10倍液；微量元素100倍液；铁盐100倍液；有机物100倍液。 (4) 培养基配置、分装、高压灭菌 (5) 筛选培养基方法，即单因子试验法、多因子试验法、广谱实验法。,第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术,本章小结：,(6) 植物培养技术：灭菌、接种、培养和驯化四个环节。 (7) 灭菌与消毒的方法。 (8) 接种程序：植物材料表面的消毒；切割外植体；将外植体移人培养基。 (9)培养方法：固体培养法和液体培养法。 (10)接种材料的培养：初代培养；继代培养；生根培养 (11)试管苗驯化：注意基质、温、光、水、肥、气的综合管理。,第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术,谢谢!,第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术,