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硝酸盐、盐度和无机碳对Porphyra torta(红藻门)幼配子体生长和色素的影响关键词:紫菜,海藻,海水养殖,生态生理学,氮,盐度,无机碳,增长速度, 藻红蛋白,色素摘要Porphyra torta Krishnamurthy(红藻门)配子的绿叶阶段,是一种在阿拉斯加海水养殖的候选种类,仅在冬季和早春生长,并仅限于阿拉斯加东南部外海岸。为了帮助确定限制这个种类的季节性和地理分布的具体环境因素,利用三个物理因素的现实环境水平进行培养实验。在代表每个因素的最高和最低水平的硝酸盐、盐度和无机碳的组合下比较幼配子体的生长和藻红蛋白的含量。复苏实验同时进行,以确定是否受低硝酸盐或盐度影响的叶片能够恢复正常生长速度和色素水平。为了在统计上作出有效的处理组生长率的比较,进行重复试验,测试了两阶段分析,并证实是适当的。低硝酸盐对于生长和藻红蛋白含量有重大的负面影响。盐度对于叶片生长有微弱的负面影响,然而无机碳既对叶片生长没有影响,对藻红蛋白含量也没有重要影响。受低硝酸盐影响的叶片,当增加硝酸盐含量时,在长达6个星期的处理后,能够恢复正常的生长速度,并高于正常水平。随着时间一开始增加,由数据得到的生长速率,依赖于硝酸盐水平。导言Porphyra torta是世界范围内已知的至少70种紫菜种类之一(Stiller & Waaland, 1993),是沿着东北太平洋的多岩石海滩上部潮间带区域的冬天及早春的栖居者(Conway & Cole, 1977; Waaland 等, 1990; Lindstrom& Cole, 1993)。P. torta和它的春天及早夏对应物P. abbottae是阿拉斯加东南部特林吉特人的传统饮食的一部分,叫做laakusk (黑海藻) (Betts, 1991)。Porphyra是世界上最古老和最重要的养殖作物品种之一,培育品种已经被选定并且在三百年间在今天的世界领先的生产商,日本、中国和韩国,被开发。Porphyra已经在华盛顿和美国缅因州和加拿大(Byce等, 1984;Waaland等, 1986; Mumford, 1987, 1990),但是它作为商业作物的潜力在北美仍然未发展(Merrill, 1993)。P. torta是几个北美西海岸种类之中,由Waaland等根据她们的商业潜力确定和Lindstrom (1993)根据在阿拉斯加的商业潜力确定。P. torta的生命周期是双相的,一个多叶,单一配子体和一个纤维状、二倍体孢子体或者丝状体(Drew, 1949; Conway & Cole,1977)。壳孢子的成熟和释放需要1个短的光周期12h或者更少(Waaland 等,1987)。这种刺激也许加上环境要求,对P. torta的叶片生长作用(Waaland et al., 1990).阿拉斯加东南部的P. torta仅限于整年盐度稳定,大约在30ppt的外面海岸地区。在内水域中,盐度季节性变动,10ppt或者更少(Conitz,1999)。这项研究涉及的问题是,低盐度是否对P. torta有限制。港湾和上部潮间带藻类通常有更广泛的耐受盐度(Russell, 1987),能经常忍受盐度短期变化,没有完全渗透调节(Kirst, 1995; Reed, 1990)。无机碳的稀释能够混淆盐度对在低盐培养基中海藻光合作用的影响(Ogata & Matsui, 1965; Ogata & Schramm, 1971;Ohno, 1976)。在东南阿拉斯加沿海水域,在强的淡水稀释期间,总无机碳能从它至少2.0meq L1的典型水平下降到1.5meq L1(Conitz, 1999)。这项研究也因此调查了无机碳稀释在低盐培养基中的影响。在沿海水域氮供应随季节强烈波动,与海藻季节性增长模式相联系(Lobban & Harrison, 1994)。在东南阿拉斯加水域,硝酸盐在早冬达到它的年度最高,大约在40-45M(Conitz, 1999)。冬天,P. torta的配子体阶段的出现可能是对季节性氮循环的适应。大多数可利用的溶解无机氮,主要是硝酸盐(NO3)和氨(NH4+),在阿拉斯加水域,很快被春季浮游植物大量出现而消耗,在晚春下降到1.0M以下,在整个夏天保持那种低水平。(Conitz,1999; Ziemann 等, 1989)。在海藻中,氮素吸收、利用和储存几个途径,能够使他们在有限的氮素环境中竞争(Lobban & Harrison, 1994),包括多余氮的积累,硝酸盐、氨基酸、蛋白质、酶或者光合色素(Hwang等, 1987; Hernndez等, 1993; Naldi & Wheeler, 1999)。光合色素已经被用来作为氮素缺乏和恢复的指标(Amano & Noda, 1987),和对于江蓠属水体氮的可及性的指标(Jones等, 1996; Horrocks等, 1995)。在这些实验中,我们假设,如果硝酸盐水平微不足道或为零,P. torta将停止生长。我们有兴趣知道硝酸盐水平略高于零是否可以支持生长。硝酸盐供应对光合色素水平的关系也考虑了。最后,我们想知道P. torta叶片的氮素消耗的影响能否被逆转,以及在什么时期。Porphyra torta能够被可靠地培养通过他的生命周期,但是叶片生长和生理的具体环境因素的影响大多未知。在华盛顿州P. torta实地栽培实验中,叶片生长被测量(Waaland等, 1986),在培养中幼叶片的生长的具体因素的作用被测定(Hannach, 1989; Hannach & Waaland, 1989)。这项研究调查了在幼P. torta叶片的生长和藻红蛋白含量对硝酸盐、盐度和无机碳原为和更低水平的依耐性。这些因素的可能的相互作用和P. torta叶片从这些因素限制中恢复的能力,被包含在实验设计中,并特别关注。材料与方法Porphyra torta Krishnamurthy丝状体(culture PtEI02a1)是1997年4月9日从阿拉斯加Elovoi岛一个叶片的单一果孢子克隆而来(5649N,13524W)。0.025g(鲜重)自由丝状体零散培养,在8h光照:16h黑暗的光周期(8:16 L:D),光子通量密度90-110mol m2s1 (PFD) and 12 。培养基时一个用Guillard的 f/2 丰富的人工海水基地(Guillard & Ryther,1962)。水运动由Labline 3-D 旋转器,30 rpm提供。包子在一批培养31/2周后被释放在一个单脉冲,到20m网格Nitex网的基板。一星期以后首先观察萌芽及附着。在最初生长期,富集培养基硝酸盐被降低到88m(f/20),其余营养盐在f/2水平,并且每周变化。孢子释放后4周,叶片附着的各自基质片段,被放在包含10mL培养基的单独的25mL锥形烧杯中,在一个实验性处理的12组合盐度、碳酸氢盐和硝酸盐,有4个重复。通过用蒸馏水或包含2.0mm NaHCO3的蒸馏水稀释AW基地,得到三个盐度水平(30,15,7.5ppt)。因此,在每个盐度水平内,碳酸氢盐要么根据盐度稀释,要么增加到保持2.0mm浓度。每隔人工海水基地混合物的一部分硝酸盐被丰富了在88m,另一部分在2.2m;其余营养物质与f/2一样。每个因素的最高水平接近环境因素的最大水平,被指定为“正常”或对照水平。(注意,两个在30ppt盐度水平的碳酸氢盐水平实际上相同的,但为了保持一种平衡因子设计,被视为单独水平。)培养是在和孢子释放期间同样的对照环境条件下生长,在上面列出,随每周培养基变化。基线测量是在同一天,但是在实验性处理之前,这个数据被指定为week0。每周一次和以下6个星期(wks 06),随机选择没培养瓶三个叶片,用来测量和藻红蛋白(PE)分析。用Optimas 4.0 图像分析软件,从叶片的录像显微镜图像,数据测量叶片表面面积。然后为了分析藻红蛋白,叶片被冷冻在0.2m NaCl 和pH 6.7的 0.2 m H2PO4/HPO42缓冲液。每个来自两个重复培养的三个叶片样品相互结合治疗,以给于足够的材料可供提取。外表皮和细胞壁要求在藻红蛋白水提取前酶切。13单位每mL提纯的木瓜蛋白酶(Sigma),用来消化表皮。鲍消化酶(Sigma,鲍鱼丙酮粉,原油)的一种过滤灭菌的提取物(H2PO4/ HPO42缓冲液),在最终浓度1.0 mg mL1,pH6.7,增加以被细胞壁消化(PolneFuller & Gibor, 1990)。在磷酸盐缓冲液的一个冻结-融化循环,细胞壁消化以后,藻红蛋白被提取,通过玻璃纤维过滤器被过滤(Advantec MFS)。这种方法被测试对对照标准,在实验样本提取之前记录光谱,以确保藻红蛋白光谱不会定性受酶切影响。对照在H2PO4/ HPO42 缓冲液的一个空白包含1.0 mg mL1鲍酶提取物,在700、588、565和455 nm读出藻红蛋白提取物的吸光度。最终藻红蛋白浓度使用公式计算,藻红蛋白= (A565 A588) ( A455- A588)0.200.12 ,并且以干重标准化。(Beer & Eshel, 1985)为了测试从任何实验处理的影响的复苏,在2、4和6周,一个子叶片被搬离每个培养瓶,并且运行在正常培养基生长10天。每个瓶的叶片随机取样测量,如上所述,在复苏期的开始和结束时期,分析藻红蛋白含量。生长实验的数据用量阶段或衍生变量分析来分析(Diggle等, 1994: pp. 154)。用试探性数据分析方法(Hoaglin等, 1983; Cleveland, 1993),叶片表面数据的-5次方跟(-0.2次方)转化,发现每个处理的面积和时间呈线性关系。在分析的第一阶段,利用转化的表面积对时间和复制品的稳健回归,得到每个处理的倾斜系数(n=4)(S-Plus 4, 1997)。在第二阶段,硝酸盐、盐度、碳X盐度的联合作用的主要影响的稳健回归系数,用方差分析研究。(Neter等, 1996)。合适尺寸被转换为原始尺寸大小,从模型的区别得到瞬时增长率。利用每周数据,方差分析硝酸盐、盐度、碳X盐度的主要影响以及硝酸盐和盐度对藻红蛋白浓度的联合作用。对于复苏数据,在10 天复苏期结束到实验处理的最后一天期间,利用方差分析叶片表面积(生长复苏)和藻红蛋白含量(藻红蛋白复苏)的不同。使用诊断和探索型数据分析方法检测假设方差分析模型的每个数据(Hoaglin等, 1983; Cleveland, 1993; S-Plus 4,1997)。结果叶片生长 (图1) 6周,盐度、无机碳和硝酸盐12个实验性处理组合下的幼P. torta叶片的生长。盐度水平是30、15、7.5ppt(1x、0.5x、0.25x正常环境水平)。盐度内嵌套的一个因素无机碳,要么像碳酸氢盐一样被增加到2.0mm,或者稀释到同盐度一样的水平。高硝酸盐是88m,低硝酸盐是2.2m,(大约分别是2X最大值和略高于极小的环境水平)。每周测量叶片表面积,n=4。用黄色光滑曲线表明生长趋势。The P. torta叶片在所有处理中经过6周实验期生长,但生长根据处理变化(图1)。F-tests的健壮回归系数对硝酸盐有意义,p=0.021。在低硝酸盐组中所有盐度水平和碳X盐度水平的生长率降低。生长率也随着盐度而下降,但差异微弱,p=0.079。t时叶片大小的模型是:y,=0i + (. + i ) t + , i = 1,.,m,其中y,是叶片面积的-0.2次方的转化,0i是i组初始面积的-0.2次方转化,.是所有组的总平均值,i是在i水平硝酸盐的解释性变量,是误差项。其余可能的解释变量,盐度和碳,不包含在内,因为它们不显著,p 0.05。叶片面积由方程预测,面积area=( y)5。t时瞬时增长率由方程预测,生长率=d(面
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