分光光度分析法： 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。包括比色法、可见分光光度法、紫 外分光光度法、红外光谱法等。 1、基本原理：朗伯-比尔吸收定律 当一束平行单色光照射到有色溶液上时，光的一部分将被溶液吸收，一部分 透过溶液，还有一部分被器皿的表面反射。在实际测量时，通常将试液和空白溶液 分别置于同样质料及厚度的吸收池中，因而反射光强度基本不变（其余条件一致）， 其影响可以不予考虑。 设入射光的强度为Io，透过光强度为It，溶液浓度为c，液层厚度为b，则： A=kbc A：吸光度，k为比例常数 其中k的值随b、c的单位而变。当c为g/l时，k用a表示，称为吸收系数 当c为mol/l时，k用表示，称为摩尔吸光系数 反映吸光物质对光吸收能力，也反映用分光光度法测定该吸光物质的灵敏度， 越大，方法的灵敏度愈高。 在多组分系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，这时体系的总吸光度等 于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性。A总=A1+A2+A3+An 吸光度与透光度的关系： It/ Io=T 2、分光光度计基本部件： 光源、单光器、吸收池（比色皿）、检测器、显示器 3、吸光度测量条件的选择 A、波长选择：以最大吸收波长为测量的入射波长称为最大吸收原则。 B、吸光度范围的选择：A为0.2-0.8，T为65-15%；当A=0.434（T=36.8%）时测量的相 对误差最小。 C、参比溶液的选择：进行测量时，利用参比溶液来调节仪器的零点，可以消除由于 吸收池壁、溶剂、试剂对入射光的反射和吸收带来的误差，并扣除干扰的影响。参 比溶液可根据下列情况来选择。 （1）纯溶剂空白：当试液、试剂及显色剂均无色时，可直接用纯溶剂（或蒸馏水） 作参比溶液。 （2）试液空白：显色剂为无色，而被测试液中存在其他有色离子，可用不加显色剂 的被测试液作参比溶液。 （3）试剂空白：试液无色，而试剂或显色剂有颜色时，可选择不加试样溶液的试剂 空白作参比溶液。 （4）显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来， 使之不再与显色剂作用，而显色剂及其它试剂均按试液测定方法加入，以此作为参 比溶液，这样就可消除显色剂和一些共存组分的干扰。 （5）改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液 消除干扰。 4、标准曲线的制作 5、示差法测量高含量组分 实验五、水中亚硝酸盐的测定实验五、水中亚硝酸盐的测定 目的要求 1. 掌握亚硝酸盐氮的测 定原理和方法。 2. 熟悉分光光度计的使 用方法。 3. 理顺氨氮的氧化与硝 酸氮的还原的过程，为 测定氨氮和硝酸盐氮奠 定基础。 4了解亚硝酸盐氮的快 速测定方法。 实验五、水中亚硝酸盐的测定实验五、水中亚硝酸盐的测定 概述 亚硝酸盐氮是无机氮化合物之一，是氨氮被氧化和硝 酸氮被还原的中间产物，不稳定。通常以其亚硝酸根 中的氮原子来计量，用符号N02-N表示。洁净地面水中 亚硝酸盐氮的含量一般不超过0.01mg/L；海水中亚硝 酸盐氮含量的变化幅度为0.130g/L。 养殖水体中的亚硝酸盐氮对水生动物具有较强的毒性， 作用机理主要是通过鱼类等的呼吸作用，亚硝酸盐由 鳃丝进入血液，使正常的血红蛋白发生氧化，输氧功 能受到影响，出现组织缺氧从而导致鱼虾缺氧，甚至 窒息死亡。亚硝酸盐还可与仲胺类反应生成致癌性的 亚硝胺类物质。 实验五、水中亚硝酸盐的测定实验五、水中亚硝酸盐的测定 方法选择 水中亚硝酸盐氮的测定方法通常采用重氮偶联 反应，使生成红紫色染料。所用重氮和偶联试剂种类 较多，最常用的一般有对氨基苯磺酸和奈胺，该法 简便，灵敏度高，但盐度对吸光度有影响，而且试剂 奈胺对人体有致癌作用，现今基本不再使用。磺胺 （对氨基苯磺酰胺）和N-（1-萘基）-乙二胺盐酸盐 （简称萘乙二胺）法灵敏度更高，反应速度快，试剂 较为稳定，而且不受盐度等组分的影响，因此，该法 是目前国内普遍采用的测定亚硝酸盐氮的方法。当将 试剂配制成固体粉末时，适合于野外快速测定。此外， 还有目前国内外普遍使用的离子色谱法和新开发的气 相分子吸收法。这两种方法虽然须使用专用仪器，但 方法简便、快速，干扰较少。 实验五、水中亚硝酸氮的测定实验五、水中亚硝酸氮的测定 磺胺和萘乙二胺试剂法磺胺和萘乙二胺试剂法 原理原理 在酸性介质中亚硝酸盐与磺胺进行重氮化反应，其产物再与盐酸萘乙二 胺偶合生成红色偶氮染料，在543nm波长处测定吸光度。本方法最低检出 浓度(以N计)为0.02mol/L，测定上限为10mol/L。 主要仪器主要仪器 分光光度计及配套比色皿、25mL具塞比色管等。 试剂试剂 1. 磺胺溶液（10g/L）：称取5g磺胺，溶于360mL盐酸溶液（1+6）中，用纯 水稀释至500mL，贮于棕色试剂瓶中，有效期为2个月。 2. 萘乙二胺溶液（1g/L）：称取0.5g盐酸萘乙二胺，溶于适量水后定容至 500mL，贮于棕色试剂瓶中置冰箱内保存，有效期为1个月。 3. 亚硝酸盐氮贮备溶液（100.0g/ml）：称取0.2463g亚硝酸钠（NaNO2，于 110烘干），溶于少量纯水中后全部转移入500mL容量瓶中，加纯水至标 线，混匀。 4. 亚硝酸盐氮使用溶液（1.000g/ml） ：取1.00mL贮备液于100mL容量瓶中， 用纯水稀释至标线，混匀。临用前配制。 实验五、水中亚硝酸氮的测定实验五、水中亚硝酸氮的测定 操作步骤操作步骤水样预处理 若水样浑浊，可通过以下方法预先处理。 可取一定体积的水样，恒温离心（4000或5000r/min，20min），取 上清液备用。 经0.45m滤膜抽滤（采用针头过滤器安装0.45m滤膜挤压过滤的方 法，操作比较方便）后得到澄清水样备用。 实验五、水中亚硝酸氮的测定实验五、水中亚硝酸氮的测定 操作步骤操作步骤制作标准曲线制作标准曲线 （1）取8支25mL具塞比色管，分别加入下表所示体积的亚硝酸盐氮标准使 用溶液，加纯水至标线，混匀。水样直接取样至标线（25ml）。 （2）每支比色管中分别加入0.5mL磺胺溶液，混匀，放置1min。 （3）分别加入0.5mL萘乙二胺溶液，混匀，放置显色15min。 （4）在波长543nm波长处，用1cm比色皿，以纯水作参比，测定吸光度Ai。 （5）以上述系列标准溶液测得的吸光度Ai扣除试剂空白（1号管）的吸光度， 得到校正吸光度Ai（同时要考虑校正Ac），以校正吸光度Ai为纵坐标，绘 制吸光度对亚硝酸盐氮质量浓度的标准曲线。 管号 12345678 ml 00.100.300.501.001.50水样1水样2 mg/L 00.00400.01200.02000.04000.0600 实验五、水中亚硝酸氮的测定实验五、水中亚硝酸氮的测定 操作步骤操作步骤水样测定水样测定 （1）取适量水样（V水样）于比色管中，用纯水定容到25mL，参照标准曲 线制作过程的步骤（2）（4），显色并测定该水样的吸光度A水样。 （2）同时取25mL纯水，代替水样重复上述操作，获得试剂空白的吸光度 （同标准曲线中的1号比色管）。将样品吸光度A水样扣除试剂空白的吸光度 （同时要考虑校正Ac），得到样品的校正吸光度A水样。 *操作步骤操作步骤比色皿校正（比色皿校正（Ac） 将4个比色皿注入纯水，以其中1个为参比溶液，测定其他3个比色皿的吸 光度Ac。若Ac不等于0，在计算结果时，应从对应的样品读数中减去Ac值。 *操作步骤操作步骤浑浊吸光值的测定浑浊吸光值的测定 若水样不经预处理，直接进行比色测定，为了得到准确的测定结果，需要 进行浑浊吸光度的测定。其方法是：取适量（与测定水样时保持一致）水 样于比色管中，用纯水定容到25mL，加入0.5mL磺胺溶液和0.5mL纯水，混 匀。放置显色15min后，测定吸光度At。在计算结果时，应从对应的样品读 数中减去At值。 实验五、水中亚硝酸氮的测定实验五、水中亚硝酸氮的测定 结果与计算结果与计算 1. 绘制标准曲线和求算回归方程：采用相应软件（如Excel） 处理标准曲线数据并绘图，横坐标为亚硝酸氮浓度 （mg/L），纵坐标为系列标准溶液的校正吸光度Ai，所 得标准曲线应为通过原点的直线，同时可求得直线回归 方程： 2. 计算含量： 水样中亚硝酸氮含量可按下式计算： 或在标准曲线图中查出亚硝酸氮含量。 - 2 mg/L NO -N Ab= - 2 mg/L NO -N mL 25.0 A bV = 水样 水样 实验五、水中亚硝酸氮的测定实验五、水中亚硝酸氮的测定 亚硝酸盐氮的快速测定法亚硝酸盐氮的快速测定法固体试剂法固体试剂法 以重氮化偶合比色法为基础，采用固体试剂和试纸法，可以快 速测定水体中亚硝酸盐氮的含量。固体试剂法的灵敏度和准确度 都较高，且试剂可长期贮存使用。试纸法操作更为简便，但灵敏 度和准确度较差。两种方法都可为野外的工作带来极大的方便。 1固体试剂：将对氨基苯磺酸盐酸奈胺酒石酸（105烘 干2h）按10189的比例，充分磨细混合，装瓶盖严，可久藏 不变。 2标准色阶的制备：取刻度和高度都相同的10mL比色管，参照上 述标准曲线的做法，分别加入一系列的亚硝酸盐氮标准使用液， 用纯水稀释至刻度，分别加入固体试剂约40mg，摇匀，放置 10min后，将所呈颜色印制下来，则得标准色阶。 3水样测定：取水样10ml与同样的比色管中，加固体试剂约 40mg，摇匀放置10min，与标准色阶比色。取与标准色阶相似的 浓度即可求得水中亚硝酸盐氮的含量。 实验六、实验六、 水中氨氮的测定水中氨氮的测定 目的要求目的要求 1掌握纳氏比色法或靛酚蓝法测定水中氨氮的原理和操 作方法。 2. 利用所学的基础知识以及基本操作和实验方法，学习 实验设计的基本方法。 *3. 了解氨氮测定的水样预处理方法及蒸馏分离装置的 安装和使用方法，目的是适应养殖废水的测定。 实验六、实验六、 水中氨氮的测定水中氨氮的测定 概述概述 氨氮亦称总氨氮，常用NH3-N表示。氨氮主要以游离氨NH3和铵盐NH4+的形 式存在于水中，两者的组成比取决于水的pH和水温。正常情况下，海水中 氨氮的含量一般在0.550g/L，但在深层缺氧的水中，可高达1.5mg/L。淡 水中的变化幅度则较大。一般认为，氨氮对水生生物具有毒害作用，但真 正构成危害的主要是非离子氨（NH3）。过高含量的NH3会损害水生生物的 重要器官，抑制其生长发育，甚至造成死亡。因此，在水产养殖过程中， 及时监测水中氨氮的含量十分必要。 实验六、实验六、 水中氨氮的测定水中氨氮的测定 方法选择方法选择 氨氮的测定通常有纳氏试剂法、靛酚蓝法（苯酚-次氯酸盐）、气 相分子吸收法、次溴酸氧化法和电极法等。纳氏试剂法具有操作 简便、灵敏度高等特点，目前在养殖生产中被广泛应用。水中钙、 镁、铁等金属离子、硫化物、醛、酮类、以及水中色度和混浊等 会干扰本法的测定，需要作相应的预处理。在测定海水时直接显 色易发生混浊，需要调整水样或试剂用量。海水氨氮监测的国家 标准法，推荐的是靛酚蓝法和次溴酸氧化法。次溴酸氧化法灵敏 度很高、反应快速、简便，但是只适用于清洁海水。对于水产养 殖水体，常常因为受到还原性物质的干扰而使测定数据不稳定、 误差较大。靛酚蓝法灵敏度略低、反应时间较长，但结果比较稳 定。电极法通常不需要对水样进行预处理，且测量浓度范围宽， 但是含量低时误差大，且需要购置专用的选择性电极和离子计。 气相分子吸收法比较简单，使用专用仪器或原子吸收仪都可达到 良好的效果。氨氮含量高时，可采用蒸馏滴定法，但一般养殖水 体达不到这一高水平。 实验六、实验六、 水中氨氮的测定水中氨氮的测定 纳氏试剂法纳氏试剂法原理原理 纳氏试剂是碘化汞钾的强碱性溶液，它能与氨氮反应 生成棕色的难溶络合物，浓度很小时，在水中以胶态形 式存在，呈现为橙黄色。反应如下式所示： 以胶体状态分散在水中的络合物，在波长420nm处， 浓度低于150mol/L(以N计)范围内，其吸光度与