HPLC的使用与维护,分析与制剂研究室 胡锋,基本原理和特点 液相色谱仪器部件 实验操作与应用 日常维护,基本原理和特点,基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附,分配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出. 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。,一些商品化仪器,脱气装置,四元泵,检测器,柱温箱,样品盘,控温箱,流动相,启动液相色谱仪器的流程,开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源， 待设备通过自检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相 过滤，脱气 色谱泵排气 用新配制的流动相灌注泵,高效液相色谱仪组成,输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统,液相色谱流程图,液相色谱的流动相,液相柱-保留值与pH的关系,pH变化值 0.1,RS变化值1.6,色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50 流速： 1.0mL/min.,2. 流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱,对溶剂的要求,水： 去离子水 自动纯水仪 纯净水 商品瓶装水 溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇） 试剂: 分析纯,不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。,过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动,过滤与脱气,流动相的保存,有机溶剂流动相： 室温下密封，避光保存 缓冲盐流动相： 当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相： 低温密封保存 防止有机相的挥发 选用适宜的容器,1梯度洗脱的特点,（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有差异, 可能会引起基线漂移,2梯度洗脱的主要条件, A 流动相/弱溶剂组成； B 流动相/强溶剂组成； 梯度时间； 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。,梯度洗脱,梯度：低压混合,低压梯度 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 如设计不当，梯度的准确性受影响 滞后体积（系统体积）设计合理,梯度滞后：系统体积的影响,注意滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路,梯度滞后大小的影响,滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好 普通分析型液相色谱的滞后体积为24ml,滞后体积变化的影响,设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性,液相色谱的色谱柱,色谱柱的连接,Stop_depth长度不合适造成柱前死体积,锥箍锥度不合适造成渗漏,色谱柱的连接,除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的固定相。 色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适的溶剂进行洗净。 采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。,可能提高柱效的方法,HPLC检测器应提供的功能,对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系,理想的HPLC检测器,高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性,灵敏度：信噪比,灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N） 检测限（LOD）：S/N = 24 定量限（LOQ）：S/N = 810 好的信噪比有利于： 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性,6:1,N,S,吸光度（Absorbance UV/Vis）检测,目前实验室中最流行的选择 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多波长，25%是PDA） 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大,吸光度检测器（UV/Vis） 优点,这种检测器简单、可靠 多数人熟悉并喜欢这种技术 可以作梯度实验并且是非破坏性的 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 一般来说灵敏度还可以,吸光度检测器（UV/Vis） 缺点,由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长 受流动相组成的影响： 用截止波长以上至少510nm作为工作波长 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响,背景吸收对紫外检测器噪音的影响,UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank,溶剂混合的基线噪音,色谱条件 色谱柱： C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C. 流动相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.1% TFA in Acetonitrile. 梯度： 5 - 40% B in 35 min. 流速： 1.0 mL/min. 样品： 水（10 L inj. vol.） 检测： 214 nm,为何如此重要？,五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。,基线噪音对积分的影响,维护流程图,吸滤头,单向阀,柱塞密封圈,线路过滤器,进样器,检测器,吸滤头定期清洗，更换溶剂时 单向阀定期清洗，压力波动大时 泵自动清洗 在线过滤器压力大时清洗,材料：不锈钢烧结，孔径10um 故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成 措施：用5稀硝酸，超声波清洗， 再用蒸馏水清洗,吸滤头,故障：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好 表现：系统压力波动大 措施： 打开排液阀，以异丙醇为流动相输液 拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗,单向阀,故障：堵塞 现象：系统压力波动大或压力 偏高 措施：5稀硝酸，超声波清洗 判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力3kgf/cm2，则堵塞。,线路过滤器,泵的保养：,使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；,柱的保养：,柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；,色谱柱柱内体积和平衡时间,单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间 色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积 流速,色谱柱清洗保存 反相色谱柱：用20%甲醇溶液清洗10个柱体积，保存在90%的甲醇溶液中。 分子筛色谱柱：用纯水清洗10个柱体积，保存在5%叠氮化钠水溶液中。 离子色谱柱：用0.02M盐，pH6.5溶液清洗10个柱体积，保存在含5%叠氮化钠0.02M盐，pH6.5溶液中。短期保存在低盐的流动相中。,灯的保养：,在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。 样品池要保养,谢谢！,今天用的图片都为 摄影协会 王诏同学所拍摄,