GB 5413.162010 1 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定方法。 本标准适用于婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本 适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 原理 利用干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）ATCC 7469 对叶酸的特异性，在含有叶酸的样品中生长产生 的酸度和形成的光密度来测定叶酸的含量。 4 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。 4.1 鸡胰腺： 称取 100 mg 干燥的鸡胰腺， 加 20 mL 蒸馏水， 搅拌 15 min， 离心 10 min （3000 转/分钟） ， 取上清液，临用前配制。 4.2 0.9 %生理盐水：称取 9.0 g 氯化钠溶解于 1000 mL 水中，分装于具塞试管中，每管 10 mL，121 灭菌 15 min。每周准备一次。 4.3 磷酸盐缓冲液 4.3.1 磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L）：称取 5.85 g 磷酸二氢钾，1.22 g 磷酸氢二钾，用 1000 mL 水溶 解。临用前按 0.5 g/100 mL 加入抗坏血酸。 4.3.2 磷酸盐缓冲液（用于谷物及谷物制品前处理）：称取 14.2 g 磷酸氢二钠，用 1000 mL 水溶解。 临用前按 1.0 g/100 mL 加入抗坏血酸，用氢氧化钠溶液 A（4.16）调 pH 至 7.80.1。 4.3.3 磷酸盐缓冲液 III（用于谷物及谷物制品测试）：称取 14.2 g 磷酸氢二钠，用 1000 mL 水溶解。 临用前按 1.0 g/100 mL 加入抗坏血酸，用氢氧化钠溶液 A（4.16）调 pH 至 6.80.1。 4.3.4 磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L）（用于谷物及谷物制品标准溶液制备）：溶解 13.61 g 磷酸二氢钾 于水中稀释到 1000 mL。用氢氧化钾溶液（4.10）调 pH 至 7.00.1。 4.4 叶酸标准品。 4.5 氨水（10.8 %）。 4.6 甲苯（C7H8）。 4.7 抗坏血酸（C6H8O6）。 4.8 菌株：干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）ATCC 7469。 GB 5413.162010 2 4.9 培养基 4.9.1 乳酸杆菌琼脂培养基：胨化乳 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氢钾 2 g， 聚山梨糖单油酸酯 1 g， 琼脂 10 g， 加蒸馏水至 1000 mL， 调 pH 至 6.8 0.2 （20 25 ） 。 121 高压灭菌 15min，备用。 4.9.2 乳酸杆菌肉汤培养基：胨化乳 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氢钾 2 g，聚山梨糖单油酸酯 1 g，加蒸馏水至 1000 mL，调 pH 至 6.8 0.2（20 25 ）。121高压灭 菌 15min，备用。 4.9.3 叶酸测定用培养基：酪蛋白胨 10 g，葡萄糖 40 g，乙酸钠 40 g，磷酸氢二钾 1 g，磷酸二氢钾 1 g，DL-色氨酸 0.2 g，L-天门冬氨酸 0.6 g，L-半胱氨酸盐酸盐 0.5 g，硫酸腺嘌呤 10 mg，盐酸鸟嘌呤 10 mg，尿嘧啶 10 mg，黄嘌呤 20 mg，聚山梨糖 0.1 g，谷光甘肽 5 mg，硫酸镁 0.4 g，氯化钠 20 mg，硫 酸亚铁 20 mg，硫酸锰 15 mg，核黄素 1 mg，p-氨基苯甲酸 2 mg，维生素 B6 4mg，盐酸硫胺素 400 g， 泛酸钙 800 g，烟酸 800 g，生物素 20 g，加蒸馏水至 1000 mL，调 pH 至 6.7 0.1（20 25 ）。 注：市售商业化合成培养基效果更稳定。 4.10 氢氧化钾溶液（4 mol/L）：称取 224 g 氢氧化钾于 1000 mL 烧杯中，用 400 mL 水溶解，冷却至 室温后，转移至 1000 mL 容量瓶中，用水定容。 4.11 木瓜蛋白酶溶液：1 g 蛋白酶（活力6000 U/mg，pH 6.0 0.1，40 ）溶于 100 mL 磷酸盐缓冲 液（4.3.1）中。临用前配制。 4.12 -淀粉酶溶液：1 g -淀粉酶（1.5 U/mg）溶于 100 mL 磷酸盐缓冲液（4.3.1）中。临用前配制。 4.13 0.22 m 灭菌滤膜。 4.14 标准溶液的制备 4.14.1 叶酸标准贮备液（500 g/mL）：称取 55 mg56 mg（精确至 0.1 mg）叶酸标准品（4.4），用 50 mL 蒸馏水转入 100 mL 容量瓶中，加 2 mL 氨水（4.5）。溶液制备后，按式（1）计算溶液的体积， 要求贮备液中叶酸盐的浓度为 500 g/mL： 贮备液体积（mL）= 500100 1000 cm 或简化为： 贮备液体积（mL）= 50 cm (1) 式中： m叶酸标准品的质量，单位为毫克（mg） ； c叶酸标准品的纯度，单位为克每百克（g/100 g） 。 用水稀释溶液至刻度，用吸管加水至计算要求的体积，充分混合，放入棕色试剂瓶中 2 4 冰 箱冷藏，保存期为 4 个月。 4.14.2 叶酸标准中间液（50 g/mL）：吸取 10 mL 叶酸标准贮备液（4.14.1）于 100 mL 棕色容量瓶 中，用水定容至刻度，充分混匀，2 4 冰箱冷藏，保存期为 1 个月。 4.14.3 叶酸标准工作液（0.05 ng/mL，0.1 ng/mL）：吸取 1 mL 叶酸标准中间液（4.14.2）于 100 mL 棕色容量瓶中，用水定容至刻度，混合。再吸该液 1 mL 于 100 mL 棕色容量瓶中，定容，混合。 从上 液中分别吸取 5 mL 于 250 mL 和 500 mL 棕色容量瓶中， 用磷酸盐缓冲液 （4.3.1） 定容到刻度， 混匀， 即为高浓度标准工作液（0.1 ng/mL）和低浓度标准工作液（0.05 ng/mL）。临用前配制。 4.15 盐酸（1 mol/L）：量取 83.0 mL 盐酸溶于水中，冷却后定容至 1000 mL。 GB 5413.162010 3 4.16 氢氧化钠溶液 A（4 mol/L）：称取 160 g 氢氧化钠于 1000 mL 烧杯中，用 400 mL 水溶解，冷却 至室温后，转移至 1000 mL 容量瓶中，用水定容。 4.17 氢氧化钠溶液 B（0.1 mol/L）：吸取 2.5 mL 氢氧化钠溶液 A（4.16）转移至 100 mL 容量瓶中用 水定容。 4.18 氢氧化钠标准滴定溶液（0.1 mol/L 0.0002 mol/L）：称取 4 g（精确至 0.0001 g）氢氧化钠用水 稀释至 1000 mL，用邻苯二甲酸氢钾标定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳渗入。 4.18.1 氢氧化钠标准溶液的标定：称取约 0.18 g（精确至 0.0001 g）于 105 110 烘至恒重的邻 苯二甲酸氢钾，用 50 mL 除二氧化碳的水溶于锥形瓶中，加两滴 5 g/L 的酚酞指示剂，用配好的氢氧化 钠溶液滴定至粉红色，同时作空白实验。按式（2）计算氢氧化钠标准溶液的浓度： c= 2042 . 0 )( m 21 VV (2) 式中： c氢氧化钠的浓度，单位为摩尔每升（mol/L） ； m称取的邻苯二甲酸氢钾的质量，单位为克（g） ； V1氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL） ； V2空白试验氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL） 。 4.18.2 酚酞溶液：取 0.5 g 酚酞溶于 75 mL 体积分数为 95 %的乙醇中，加入 20 mL 水，再加入氢氧 化钠溶液（4.18），直至加入一滴立即变成粉红色，再用水定容至 100 mL。 4.19 溴麝香草酚蓝指示剂：称取 0.1 g 溴麝香草酚蓝于研钵中，加入 1.6 mL 氢氧化钠溶液 B（4.17） 研磨，加少许水至完全溶解，转移至 250 mL 容量瓶中用水定容。 5 仪器和设备 5.1 pH 计：精度为 0.01。 5.2 离心机：转速2000 转/分钟。 5.3 分光光度仪。 5.4 天平：感量为 0.1 mg。 5.5 生化培养箱：36 1 5.6 滴定管：分刻度值为 0.1 mL。 5.7 涡旋振荡器。 6 分析步骤 6.1 测试菌液的制备 6.1.1 干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei） ATCC 7469 冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤培养基 （4.9.2） 中， 36 1 培养 24 h 后，转接至乳酸杆菌琼脂培养基（4.9.1）试管中，再 36 1 培养 24 h。培养好的 乳酸杆菌琼脂培养基（4.9.1）试管的培养物作为贮备菌种。 GB 5413.162010 4 6.1.2 从贮备菌种培养基上分别转接到三个乳酸杆菌琼脂培养基 （4.9.1） 试管中， 放入培养箱中 36 1 培养 24 h。每月转接一次，作为月接种管贮于冰箱中。每月定期从月接种管中重新接种 3 个转接管保 存新菌株。 6.1.3 从月接种的培养管中的一支再接种一支乳酸杆菌琼脂培养基 （4.9.1） 试管， 36 1 培养 24 h， 作为日接种管每日测定用。 6.1.4 从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤培养基（4.9.2），36 1 培养 24 h。在无菌条件下离 心该培养液 10 min （2000 转/分钟） ， 弃去上清液。 用 10 mL 生理盐水 （4.2） 振荡洗涤菌体， 离心 10 min （2000 转/分钟），弃去上清液，用 10 mL 生理盐水（4.2）振荡清洗。如前离心操作，弃去上清液。再 加 10 mL 生理盐水（4.2），混匀。吸 1 mL 该菌悬液于 10 mL 生理盐水（4.2）中，混匀制成测试菌液。 6.1.5 以生理盐水（4.2）做对照，用分光光度计，于 550 nm 波长下，测测试菌液（6.1.4）的光密度 值，此值应在 60 %80 %之间。 6.2 试样的制备 6.2.1 乳制品 称取 2 g（精确至 0.0001 g）试样（约含叶酸 5 g）于 100 mL 烧杯中，用 25 mL30 mL 水复原样 品，转入 100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，溶液中叶酸的质量浓度大约为 0.05 g/mL。吸取 1 mL 该样液和 1 mL 鸡胰腺（4.1）于一个 180 mm15 mm 的带螺旋盖的试管中，充分混合。加 18 mL 含抗 坏血酸的磷酸缓冲液（4.3.1） ，再加 1 mL 甲苯（4.6） 。同时制备空白对照管，吸 1 mL 蒸馏水和 1 mL 鸡胰腺（4.1）于空白管中，加 18 mL 含抗坏血酸的磷酸缓冲液（4.3.1）及 1 mL 甲苯（4.6） 。在 37 下，样品管和空白管保温 16 h 后，于 100 水浴加热 5 min。用磷酸盐缓冲液（4.3.1）作适当稀释， 得到浓度约为 0.1 ng/mL 的叶酸盐溶液。 若确定样品中强化叶酸与原生叶酸相比所占比例很大， 则可以用 1 mL 样液加 19 mL 含抗坏血酸的 磷酸缓冲液（4.3.1）于 100 水浴加热 5 min，再用磷酸盐缓冲液（4.3.1）稀释，得到浓度约为 0.1 ng/mL 的叶酸盐溶液。 6.2.2 谷物及谷物制品 称取大约含 1 g 叶酸的试样于 150 mL 三角烧瓶中。加 20 mL pH 7.8 磷酸缓冲溶液（4.3.2） ，混 匀后加 50 mL 水和 1.0 mL 甲苯（4.6