实验方案实验 外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。2、初步掌握人类染色体G带的显示方法及人类染色体G带在染色体识别中的意义。3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。 二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为122号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母AG表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。表1 人染色体组型及其特征组别染色体序号形态，大小着丝点位置次缢痕随体A 13 最大中部着丝粒（1，3）亚中部着丝粒（2）1号染色体B 45 次大亚中部着丝粒C 612X 中等亚中部着丝粒9号染色体D 1315 中等近端着丝粒有E 1618 小中部着丝粒亚中部着丝粒16号染色体F 1920 次小中部着丝粒G2122Y最小近端着丝粒有三、实验试剂与器材试剂：抗凝剂：肝素溶液（500U/ml）；培养基：RPMI1640, 按照说明书配制后抽滤、分装，冻存备用。小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56水浴条件灭活。植物血球凝集素（PHA）：市售，按说明书要求使用 5%NaHCO3秋水仙素：已有，1ug/ml，根据需要量取！低渗溶液：0.075mol/L氯化钾 班上同意配制，我们组负责配！Carnoy固定液Giemsa染液：磷酸缓冲液（pH6.8）10ml加Giemsa原液0.3ml，用时配制。器材：光学显微镜 1台，离心机 1台，恒温水浴箱 1台，恒温箱 1台，离心管17支，量简2个，烧杯 2只，培养瓶2个，载玻片8张，玻片架 2台，注射器 4支，枪头2支，移液枪2支，胶塞2个，标签纸1圈，碘酒和酒精棉球，酒精灯，1台，天平 1台，普通冰箱 1台，立式染缸 1个、染色架 1个、镊子3个，直头小吸管 14支、橡皮吸头14个、吸水纸 若干，香柏油，擦镜纸，剪子 1个，胶水。正常人类染色体G带核型图，核型报告纸四、实验方法（一）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）；每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液，其中含：RPMI1640 4ml灭活小牛血清 1mlPHA 2.5mg依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混合均匀，用5%NaHCO3调节培养基的pH值至7.2-7.4。（二）采血与培养：先以碘酒和75%乙醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血1ml。转动针筒以混匀肝素常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台 ，在火焰旁将血液滴入23个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶0.20.3ml（6号针头45度倾斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37恒温箱内静置培养72h。（每天摇动培养瓶一次）（三）秋水仙素处理: 向经恒温培养68-72小时的外周血淋巴细胞培养液中加入秋水仙素，使其终浓度为0.4ug/ml,即每瓶（内装5ml培养基）中用6号针头倾斜45度角滴4滴，轻轻将液体摇匀，继续恒温培养3-4小时。（四）标本的制备: 1、终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内，离心沉淀10分钟(1000r/min)，弃去上清液。2、加入37预温的低渗液8m1，轻轻打匀，置37水浴箱中20分钟。（使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。）3、低渗处理完毕后，直接加入新配的固定液1 m1进行预固定，混匀后，离心10分钟(2000r/min)。 4、弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入固定液4m1，轻轻吹打混匀，置室温15分钟。5、离心沉淀1000 r/min，10分钟。6、弃去上情液，再加入固定液4m1吹打均匀重悬细胞，固定10分钟。7、离心沉淀1000 r/min，10分钟。8、重复固定一次。9、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多少加入适量固定液(0.30.6m1)，轻轻吹打成细胞悬液。10、滴片：取保存在冰水中的冷湿载玻片1张，稍倾斜，用滴管吸取细胞悬液，从3040cm高处滴2滴于玻片上，立即用口对准玻片吹气，使细胞在玻片上散开，然后在酒精灯上略烘一下(勿全烘干，过火3-5次)，在空气中待干。（四）染色：1、滴有细胞悬液的载片反扣在染色板上，使片、板之间有一缝隙，将稀释后的Giemsa染色滴在片隙中，室温染色20分钟；2、自来水轻轻冲洗（冲洗标本片的背面）35秒钟，晾干；3、镜下观察染色体分带及染色情况。五、实验结果 1、观察自己制作的标本片中染色体的形态、颜色及其显带情况，记录并说明原因。计数10个细胞的染色体数。2、试述染色体G显带技术在人类染色体识别中的意义。3、绘出一套完整的中期分裂细胞的染色体图；根据课堂提供的材料，排列初一份正常人类染色体G带核型图。4、实验报告六、注意事项（一）细胞培养技术1、在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。2、无菌操作的要领和要求1）培养前准备 为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。2）超净工作台消毒 打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。3）洗手 操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2% 新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。4）火焰消毒 在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。烧过的用具都要待冷却后再接触细胞，否则会烧焦形成炭膜，再用时会把有害物质带入培养液中。5）操作 进行培养操作时动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动增加污染机会。不能用手触及器皿的消毒部分。如已接触，要用火焰烧灼消毒或更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理布局。原则上是右手使用方便的用品放在右侧，左手使用方便的用品放在左侧；酒精灯置于中央。培养液等不要过早开瓶，打开的培养液和培养用瓶等应保持斜位或平放，长时间开口直立，易增加落菌机会。吸取各种用液时均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。（二）染色体染色体是生物细胞中的一个重要的组成部分，每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体。染色体能通过细胞分裂而复制。并且在世代相传的过程中具有稳定地保持形态、结构和功能的特征。染色体是遗传物质的载体。人类99%的遗传物质位于染色体上。染色体数目、结构的改变将导致染色体病。（三）操作1、接种的血样越新鲜越好，最好是在采血后24h内培养，如不能立刻培养，应置于4冰箱存放，避免保存时间过久，以免影响细胞的活力。培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻震荡，使凝块散开，继续放回37恒温箱内培养，最好每天轻轻震荡混匀一次。2、Giemsa为噻嗪类染料 ,其碱性成份天青 B与 DNA分子中的磷酸基结合 ,蛋白质在一定的环境中 ,具有不同的嗜酸性和嗜硷性倾向 ,出现着色差异易于观察。因此染液PH值对着色效果有影响。当呈淡灰色带纹不显时 ,应调节染液 pH值7.07.2,复染 10min,可获得鲜亮的显色效果。3、在采血接种培养是，不要加入太多的肝素。肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴细胞的转化和分裂。但肝素量也不应太少，以免发生凝血或培养物中出现纤维蛋白形成的膜状结构。这种膜状物一般在培养24小时左右出现，此时可在无菌条件下将它除去以免影响培养效果。4、 在普通培养箱内培养时，必须将培养瓶口盖紧，以免培养液的PH发生较大的变化。如果培养过程中，培养液酸化比较严重（培养液呈黄色时）将不利于细胞生长，此时可加入适量无菌的0.14%碳酸氢钠溶液调整或再加入23ml培养液来校正。培养箱的温度应控制在37+0.5，温度过高或过低都会影响细胞的生长。5、染色体标本质量不佳的原因。如果淋巴细胞转化试验表明培养物生长发育良好，但制成的标本质量不佳时，其原因可能为： 秋水仙素处理不当：一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。 低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂，以致分裂细胞或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。 离心速度不合适：如果从培养瓶收集细胞后进行离心时的速度太低，细胞可能被丢失；如果细胞被低渗后离心速度过高，往往使分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相丢失，以致制出的标本分裂相较少或大部分为剩余的分散不好的分裂相。 标本固定不充分：如固定液不新鲜，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模糊、不分散，其周围有细胞浆的蓝色背景。 载玻片清洗不彻底：玻片有油迹，致使滴在载玻片上的细胞悬液不能均匀分散，且细胞随液体流动而丢失。 载玻片冷冻不够：合适的冰湿玻片，从冰水中拿出时，其表面有一层霜雪。如冷冻不够则无此现象，此时细胞难以贴附在载玻片上。6、下列因素对染色体G显带有一定的影响。（1）制作标本的方法：火焰干燥法制得的标本对胰蛋白酶处理的抵抗性较气干法标本要强些。（2） 染色：随着染色时间的延长，在染液表面会形成一层氧化膜（发亮）。染色完毕，应把标本浸入