植物材料基因组多态性分析原理一、RAPD 技术的原理RAPD技术是由美国的 Williams等人于 1990年发明的。它是以聚合酶链反应技术(PCR 技术)为基础，利用人工合成的寡核苷酸为引物，以从组织中分离出来的基因组 DNA为模板，通过基因放大器合成多态性 DNA片段的一种方法。由于不同品种 DNA序列存在着差异，其引物结合位点以及两结合位点之间的距离都有差异，这样经 PCR扩增后就产生了 DNA片段的多态性，从而形成了 RAPD标记。RAPD 标记具有以下特点：、标记数量多，因为 RAPD分析所用引物的数量是无限的，所以它可以覆盖基因组中所有的位点。、标记所需模板 DNA量小，因此不受季节、组织、器官及发育时期的限制。、所用引物没有物种限制，一套引物可以用于不同生物基因组分析。、分析方便、快速、无需克隆自卑、同位素标记、Southern 转移等复杂的操作。、标记是显性的，因此不能区别生物个体是纯合型还是杂合型。目前，RAPD 技术已广泛用于基因定位，寻找特定基因的连锁标记，物种识别， 系统进化，遗传多样性检测，遗传作图和遗传育种等众多领域。由于 RAPD技术是以 PCR技术为基础的，因此为了更好的掌握 RAPD技术，有必要先了解 PCR技术。1、PCR 技术的原理多聚酶链式反应技术简称 PCR技术，是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，此法操作简单，可在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝，因此 PCR技术虽然问世时间仅数年，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域。在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面得到了广泛的应用。PCR技术与细胞内发生的复制过程十分类似，为在模板 DNA、引物（16bp 以上，最好为 2024bp）和 4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于 DNA聚合酶的酶促合成反应。按照反应的特点可将其分为三步：、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双连解开形成单链；、退火：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物 DNA量大大多于模板，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板 DNA双链之间互补的机会较少；、延伸：在 DNA聚合酶和 4种脱氧核苷三磷酸底物及 Mg2+存在的条件下，由 DNA聚合酶 5 3的聚合酶活性催化以引物为起点的 DNA链延伸反应。以上 3步为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性 DNA片段将得到大量的复制，数量可达到21067拷贝。（DNA分子数2 2530）循环2530次目的DNA数目达到10 675 33 55 3 3 594变性，双链DNA分子解链成为两条单链5 3 3 5引物1 引物2 55退火，引物与模板DNA 结合72延伸，以引物为起点延伸DNA 链5 33 5 3 5（DNA分子数21）94变性（第2次循环） 5 3 5 3 5 3 5 3 引物1 引物2 55退火5 33 55 3 5 3 5 35 3 3 55 3 72延伸（DNA分子数2 2）如图所示，经过高温变性，低温退火和中温延伸 3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。每循环一次，目的 DNA的拷贝数加倍，随着循环此数的增加，目的 DNA以 2n的形式堆积。PCR 扩增的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物所决定的。在反应的最初阶段，原来的 DNA担负着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物 5末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物 5之间的 DNA片段。2、RAPD 的原理RAPD技术通常是利用一系列（通常数百个）不同碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸单链（通常为 10bp）为引物，对所研究基因组 DNA进行 PCR扩增。RAPD 所用的一系列引物 DNA序列各不相同，但对于任一一对特定的引物（可相同也可不同） ，如它们同基因组 DNA序列有其特定的结合位点，这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合 PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物 3端相距在一定的长度范围之内（2002000bp） ，就可扩增出 DNA片断。因此如果基因组在这些区域发生 DNA片断插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使 PCR产物增加、缺失或发生分子量的改变。通过对扩增产物的检测即可测出基因组 DNA在这些区域的多态性，由于进行 RAPD分析时可用引物数很大，虽然对每一对引物而言其检测基因组 DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组，因此 RAPD可以对整个基因组 DNA进行多态性检测。两个物种的个体之间，亲缘关系越接近，其相应的 PCR扩增带型也就越相似，反之则差异也就越悬殊。二、多态性 DNA随机放大的条件大多在 Williams等（1990）的基础上变动。一般每一个样品的最后混合液为25ul，其中含 25ul 10的 DNA聚合酶缓冲液（由 Tris-HCl，KCl，MgCl 2和明胶等配成） ，各占 100umol/L的 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP，02umol/L 的引物，2025ng的模板 DNA和 05 单位酶量的 DNA聚合酶，然后用蒸馏水将混合物加到 25ul。三、影响 RAPD的因素1、引物引物的合成是随机的，但要满足以下两个条件：G+C 的含量不低于 40%，5 与 3端的碱基顺序非反方向对称，否则就无法合成专一的少数几条 DNA片段。引物的长度以 10bp为佳，引物太短（9bp）易从模板上脱落，聚合反应难以进行，引物太长，成本提高，合成多态性 DNA片段的可能性降低。引物的浓度通常是 02umol/L，这一浓度足以完成 40个循环的扩增反应，引物浓度过高可能导致错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，这两者均可竞争酶、dNTP 和引物。但如引物浓度不足，则 PCR的效率极低，扩增产物的产量太低。2、Taq DNA 聚合酶：酶在 7075时具有最高的活力，此温度下每一个酶蛋白分子每秒可延伸约 150个核苷酸，温度升高（80）或降低（70）时，聚合酶延伸速度明显下降。该酶具有良好的热稳定性，95保温 2小时，活性未见明显损失。该酶具 53聚合酶活性和 53外切酶活力，但无 35的外切酶活力，因此，如 PCR反应中发生某些核苷酸的错配，该酶没有校正功能。该酶为 Mg2+依赖性酶，MgCl 2浓度在 20mmol/L 时酶活力最高，Mg 2+浓度偏高，酶活力受抑制。由于 Mg2+能与负离子或负离子团（如磷酸根等）结合，在PCR反应中模板 DNA、引物及 dNTP均可与 Mg2+结合，尤以 dNTP的影响最大，所以 MgCl2浓度在不同反应体系中应适当进行调整，一般反应中 Mg2+浓度至少应比 dNTP总浓度高出 0510mmol/L。KCl的最适浓度是 50mmol/L，高于 75mmol/L时 PCR反应明显抑制，均衡的dNTP有利于酶活性的发挥，并能减少错配和获得多量的特异性 DNA扩增产物。在 25ul反应体系中，聚合酶的用量为 12U，根据扩增片断的长度及复杂程度（G+C 含量）不同而有所区别，使用聚合酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度过低，则合成的产物量减少。3、底物（dNTPs）dNTPs溶液应在-20存放，过多的冻融会使 dNTPs降解。在 RAPD反应中， dNTPs浓度系在饱和浓度(200umol/L)下使用，dNTPs 浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本，反之，低浓度的 dNTPs会导致反应速度的下降，但可提高试验的精确性。4 种 dNTPs在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率，此外，由于 dNTPs可能与 Mg2+结合，因此，应注意 Mg2+浓度和 dNTPs浓度之间的关系。4、反应的缓冲液缓冲液成分：50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl （室温下pH=84） 15mmol/L MgCl 2缓冲液中 MgCl2能影响反应的特异性和扩增片断的产率，在一般的 PCR反应中，1520mmol/L 是比较合适的（对应 dNTP浓度为 200umol/L左右） ，Mg 2+过量能增加非特异扩增并影响产率。由于 Mg2+的最佳作用浓度相当低，因此所制备的模板 DNA中不应含有高浓度的鳌合剂，如 EDTA，不应含有高浓度的带负电荷的离子基团，如磷酸根。缓冲液中的 BSA和明胶对酶起保护作用。KCl 在 50mmol/L时能促进引物退火，大于此浓度时将会抑制 TaqDNA聚合酶的活性。1050mmol/L Tris-HCl，pH84，起调节 pH使 TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。5、RAPD 的循环参数PCR扩增是由变性、退火、 （复性）和延伸三个步骤反复循环组成的。其中每一步的温度、时间以及循环次数等参数是非常重要的。、变性一般选择 94，30s1min，可使各种复杂的 DNA分子完全变性。应根据模板 DNA的复杂程度，调整变性温度和时间。对 GC含量高的 DNA，应用较高的变性温度和时间。若变性不充分，会影响 PCR产物的产量，反之若过度变性（温度过高，时间过长）会对 TaqDNA聚合酶活性和 dNTP分子造成损坏。RAPD 反应由于用基因组 DNA，因此变性时间稍长为 1min。、退火由于 RAPD的引物短，因此退火温度应比常规 PCR温度（50）低，为 36，温度过高会引起引物从模板上脱落。退火时间也比常规 PCR(30s)长，为1min30s，以利于引物与模板 DNA的牢固结合。、延伸延伸温度应选择在 7075之间，此时，TaqDNA 聚合酶具最高活力。RAPD反应由于引物过短，延伸温度不利过高，否则不利于引物与模板的结合。RAPD中可采用使反应温度缓慢升高到 7075的方法，因为在最初较低温度下，DNA聚合酶已催化延伸反应开始（15 个 bp/s） ，接下来的较高温度不会对这种延伸过的引物和 DNA模板的结合发生影响。延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1分钟延伸足以完成 2kb的序列，扩增片段在 2kb以上，则需加长延伸时间。RAPD 反应由于扩增片段的长度是随机的，有可能有 2kb以上的片段，因此延伸时间比常规 PCR(1min)长，为 1min30s。、循环次数RAPD一般为 3540个，循环次数的选择主要取决于模板 DNA的浓度，浓度高，则循环次数可降低，过高的循环次数（40 次） ，则会增加非特异性产物的量及其复杂度。5、模板RAPD反应由于引物序列短，扩增片段随机，因此为获得理想的结果，除模板中不应含有高浓度的 EDTA和盐离子外，对模板的纯度要求甚高，OD 260/OD280最好在 18，OD 260/OD230 20，工作浓度一般为 50100ng。此外，如模板为环状，则应先将其线状化，因闭环 DNA的扩增效率低。