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不读万卷书,行万里路,完成工作的方法,是爱惜每一分钟!内质网应激与心肌损伤内质网应激与心肌缺血再灌注损伤关键词 内质网应激;心肌;缺血再灌注损伤内质网(ER)是真核细胞中重要的细胞器,它可以正确地折叠蛋白质三维空间构象、储存Ca2+、合成膜蛋白及分泌蛋白,并参与胆固醇及脂质的生物合成,在哺乳动物相关信号通路中起着至关重要的作用。内质网的内环境稳定是实现其功能的基本条件。内质网如果发生错误的蛋白质聚集、Ca2+耗竭或超负荷、脂质合成紊乱、蛋白质糖基化形成障碍或蛋白质不能形成正常的二硫键等均可引起内质网功能紊乱,这一亚细胞病理过程称为内质网应激(ERS)。细胞为了生存,产生针对ERS的反应,称为ERS反应,一般用未折叠蛋白提示内质网发生了应激反应。近年来对于ERS反应的研究愈来愈多,ERS在多种疾病(如心血管疾病、糖尿病、帕金森病、病毒感染性疾病等)的发生、发展中起着重要的作用1。本文重点阐述ERS发生的分子生物学基础、ERS在心肌缺血再灌注损伤中的作用、针对ERS防治心肌损伤的研究进展。1ERS发生的分子生物学基础1.1 基因活化 ER跨膜蛋白激酶(IRE)-1具有内切酶活性,应激时,通过自身核酸内切酶,选择性剪切X盒结合蛋白(XBP)-1的mRNA,去除26 bp内含子序列从而进一步使蛋白翻译移码并产生XBP-1蛋白,并由此转录并活化ERS反应元件(ERSE)基因。转录激活因子(ATF)-4在未应激时可以干扰转录本上游5非翻译端短暂开放性阅读框,从而使起始密码子不能有效识别,不能有效翻译。但在应激时,短暂开放阅读框不能利用,ATF-4蛋白显著升高,其表达产物在核内聚集促使葡萄糖调节蛋白前体78(GRP78)/免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)/生长抑制和DNA损伤诱导基因(GADD)153、X盒结合蛋白(XBP)-1、GADD34等部分基因表达。ATF-6在ERS后从内质网转移到高尔基体,特异蛋白酶S1P和S2P从膜上水解其反式激活结构域,并转移到细胞核中与ERSE作用,激活较多ERS反应蛋白的转录,如:GRP78/Bip、CHOP/GADD153、XBP-1等。特异水解酶同时可以识别并裂解激活固醇调节元件结合蛋白(SREBPs),增加细胞脂质合成。1.2 早期蛋白质生物合成暂缓 蛋白质在ER上核糖体合成输出之前,必须进行正确的折叠包装。ER蛋白质折叠需要在氧化还原条件下进行,需要两种ERS反应蛋白,分别是ERS氧化还原酶(ERO)1和二硫化蛋白水解酶。一般情况下,真核细胞中分别由ER跨膜蛋白肌醇酶(IRE)-1、ATF-6、蛋白激酶R样ER激酶(PERK)这三种感应蛋白介导蛋白质的不正确折叠。当应激反应时,这三种蛋白与GPR78/Bip分离并自身激活,引起蛋白质折叠错误,进而引起ERS。这种蛋白质折叠错误引起的ERS反应称为“未折叠蛋白反应”(UPR)。心肌细胞特异的ER蛋白增强PERK的表达及磷酸化,增加转录激活因子CHOP表达,对ERS起到心肌保护作用2。PERK自我磷酸化激活剂自我聚集将磷酸化真核细胞翻译起始因子2的色氨酸(Ser)51磷酸化,阻止与三磷酸尿苷(GTP)结合,使起始蛋氨酸-RNA与核糖体结合无法进行初始翻译,阻断新生蛋白质向ER运输,避免ER超负荷。1.3 ER内错误蛋白降解 ER是真核细胞蛋白质质量鉴别、控制和校正装置,保证合格蛋白的输出,不能正确折叠的蛋白质可以通过此系统从ER逆转至细胞质并被26S蛋白酶体降解3。1.4 ER性细胞凋亡的发生 ERS后,通过一系列信号传导通路,引起细胞凋亡,称为ER相关性死亡(ERAD)。这一过程,由多种蛋白、蛋白水解酶及基因参与。CHOP基因的启动子上含有氨基酸应答元件(AARE),AARE或相关元件可以调节CHOP蛋白表达ER的应激或氨基酸剥夺4, 5。CHOP蛋白或与CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)或Jun/Fos家族蛋白形成杂二聚体,并进一步调节下游相关凋亡基因的表达。实验证明,如果在细胞中加入可使Ca2+从ER转运到胞浆中的毒胡萝卜内脂(TG)后,随着作用时间延长,CHOP大量表达可进一步导致细胞生长停止、死亡;但如果删除CHOP蛋白转录调控区的转基因后,细胞加入这种试剂后细胞凋亡可以明显减弱,进一步表明CHOP介导了TG导致ERS时的细胞凋亡6。c-Jun氨基末端激酶(JNK)家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一员7,可介导细胞凋亡的发生8,在多种疾病的发生发展中发挥重要作用。JNK对转录因子氨基末端进行磷酸化修饰、激活转录因子并调节下游相关靶基因的转录和凋亡蛋白的表达9,是ERS后细胞凋亡的重要中间信号分子。活化的JNK进入细胞核,激活相应转录因子后,还可诱导细胞死亡介导因子(Bim)、BH3结构域凋亡诱导蛋白(Bid)等BH3结构域(BH3-only)蛋白表达,从而活化Bax等促凋亡蛋白。这种活化途径原本认为只存在于线粒体,但目前研究表明同样存在于ER,但途径略有不同,需要ER特有含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-12和Ca2+参与,也提示ER与线粒体引起细胞凋亡存在不同信号传导途径10。近些年发现一种Gipie蛋白,隶属于辅伴侣分子Girdin家族,可稳固GRP78与IRE1的结合并减弱IRE1诱导的JNK激活途径,从而抑制细胞凋亡11。ER性细胞凋亡的最终执行者是含有水解酶功能的Caspase蛋白水解酶,特征性Caspase-12仅存在于ER。ERS时与Caspase-12结合的伴侣蛋白Bip减少,Caspase-12暴露活化后可引起细胞凋亡12。2ERS在心肌缺血再灌注损伤中的作用2.1 Ca2+失衡引起了ERS 心肌收缩依靠心肌细胞的兴奋收缩偶联,Ca2+的内外平衡是关键。同样,在心肌细胞中有丰富的ER,亦称之为肌浆网,当肌浆网内Ca2+清空时细胞浆内Ca2+超载,ER中钙稳态失衡可诱发过度ERS13。创伤、失血、再灌注等多种因素引起的心肌细胞损伤均与蛋白质折叠有关,Ca2+超载是其主要机制,因此,钙超载致ER的应激在心肌损伤中起着重要的作用。心肌缺血后再灌注过程中,Na+-Ca2+交换和L型钙通道被阻断,Ca2+敏感受体表达增多,1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)蛋白表达增多,释放Ca2+,直接引起细胞内钙超载,诱发ERS14。同时有研究发现,ER特异性凋亡蛋白Caspase-12活化片段表达增多,这进一步诠释了ERS在心肌损伤中的作用15。2.2 ERS相关蛋白过表达引起了ERS 在乳鼠缺氧复氧心肌缺血再灌注模型上,发现缺氧复氧心肌活力减低,胞内乳酸脱氢酶漏出,心肌细胞ERS蛋白GRP78表达增加,持续24 h;表明缺氧复氧诱导GRP78表达增加,引起心肌细胞ERS16。Petrovski等17应用不同剂量的衣霉素或TG诱导心肌溶解的模型,发现衣霉素或TG均引起了心肌细胞ERS,eIF2和PERK活化增强,CHOP表达增多,引起了心肌细胞的自噬现象;最为关键的是,小剂量的衣霉素或TG提高了左心室功能、减少了心肌梗死面积与细胞凋亡;相反,大剂量的衣霉素或TG增加了心肌细胞损伤。同时发现,心肌缺血再灌注中低氧引起的ERS导致的基因表达重塑,可影响心肌细胞存活18。与缺氧密切相关的缺氧诱导因子(HIF1),在轻度低氧时活性无明显变化;但内源性HIF1诱导基因抑制因子增多,通过ATF6通路GRP78基因诱导ERSE转录,介导缺血性损伤。心肌缺血过程中,ERS被激活,但再灌注时为非激活状态。通过RNA干扰技术或基因敲除技术阻断ATF6后GRP78表达明显降低,心肌细胞凋亡增加19,提示ATF6在缺血再灌注过程中起到存在类似预处理保护作用,说明在ERS中被调整的部分基因在心肌缺血时编码的蛋白对心肌具有保护作用。Ngoh等20研究发现,增强0位N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰可以减少ERS诱发的心肌细胞死亡。心肌受损扩张时,ER膨胀,CHOP/GADD153表达增加,能够易化ER单板的靶向运转的赖-天冬-谷-亮氨酸四肽序列(KDEL)受体突变并引起细胞凋亡增加21。热休克蛋白(HSP)72通过物理干扰,加强IRE1a-XBP1信号可以保护细胞免受ERS诱导的细胞凋亡22。可见,过度表达的ERS相关蛋白在引起ERS的同时,加重了心肌细胞损伤。3以ERS为切入点,防治心肌损伤的研究 在衣霉素诱导ER反应的心肌细胞和离体心肌缺血再灌注损伤心脏中,加入蛋白激酶C抑制剂可降低其诱导标志物CHOP及GRP78、磷酸化JNK蛋白水平,抑制心肌细胞凋亡,对心脏具有保护作用23。加入脯氨酰羟化酶抑制剂酶可以诱导缺血再灌注心肌的ATF4、GRP78和A甘露糖苷酶样ER降解增强蛋白表达,有效减少CHOP表达从而起到减轻缺血后心肌损伤24。同样,增加活化ATP6或药物激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)可以减少缺血再灌注后的心肌损伤,增强心室功能、减轻心肌细胞耗氧25, 26。祝筱梅27等建立缺氧/复氧模型,低氧预处理诱导p38MAPK磷酸化水平升高,低氧预处理前应用p38MAPK特异性抑制剂可消除低氧预处理诱导的钙网蛋白表达上调,并明显消弱低氧预处理抑制缺氧/复氧诱导的Caspase-12活化的作用,这对稳定细胞功能减缓应激状态及减轻ERS介导的细胞凋亡有着重要作用。另外,研究发现缺血再灌注初短暂低pH液复灌可抑制过度ERS,减轻ER凋亡信号介导的细胞凋亡发生保护心肌28。此外,有研究发现牛磺酸可明显降低烧伤大鼠的GRP94的表达和Caspase-3活性,降低心肌细胞ERS,从而减轻烧伤引起的心肌损伤29。前期研究也表明,肠淋巴管结扎减少肠淋巴液回流可减少二次打击大鼠心肌细胞亡,降低细胞损伤30,但其机制是否与抑制心肌细胞ERS有关,还有待进一步观察。可见,掌握心肌细胞损伤时ERS反应发生的机理,对于心肌损伤的防治具有较大的指导意义。当然,大多数研究还处于动物实验,应进一步开展相关的转化医学研究,尽早应用到临床患者心肌损伤的防治。4小结与展望ERS反应是一种多信号通路、多基因表达并由多种应激因素参与的过程。在轻度或早期心肌损伤时,ERS反应有多种保护分子蛋白参与,对于细胞抵抗病理应激有积极的保护作用。过长时间或过度的ERS,多种应激反应的共同通路,导致基因过表达、蛋白质折叠等,可引起细胞功能紊乱,导致细胞溶解、凋亡、坏死,参与多种心血管疾病的发生发展。目前对于ERS与心血管疾病的研究逐渐深入;但是我们也应该看到,参与ERS的因素很多,迄今为止对ERS反应机制的了解,还不深入。通过细胞生物学、分子生物学、病理生理学以及临床医学的深入研究,最终会全面透彻地认识ERS反应的机制,并进一步应用于心肌损伤的防治。参考文献1. Kaufman R J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease J. J Clin Invest, 2002; 110: 1389-98. 2. Isodono K, Takahashi T, Imoto H, et al. PARM-1 is an endoplasmic reticulum molecule involved in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in rat cardiac myocytes J. PLoS One, 2021; 5(3): e974601-10.3. Araki E, Oyadomari D, Mori M. Endoplasmic reticulum stress and diabetes mel
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