毕 业 论 文（设计）题 目 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 指导老师 张波 专业班级 食品营养与检测 122 姓 名 薛雨霖 浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）学 号 20127100213 2015 年 5 月 28 日浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）I摘要：蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸） ，在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660nm 测定其吸光度，计算出蛋白酶活力。本实验确定了样品的提取液为蒸馏水、底物酪蛋白用量为1mL、样品的稀释倍数（酸性蛋白酶为1500-2500，中性蛋白酶为500-2000） ，并对样品中酸性和中性蛋白酶活力的稳定性进行测定，测得的稳定性较高。本方法测得的两种样品的标准偏差均小于10%，因此该方法具有良好的精密度。关键词：饲料添加剂；酸性和中性蛋白酶；酶活力浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）II目 录引言 .11 材料和仪器 .11.1 原料 .11.2 仪器设备 .11.3 主要试剂 .12 实验方法 .22.1 主要试剂的配制 .22.1.1 1mol/L 及 0.1mol/L 的盐酸溶液的配制 .22.1.2 0.4mol/L 的碳酸钠溶液的配制 .22.1.3 福林试剂的配制 .22.1.4 pH3.5 乳酸缓冲液的配制 .22.1.5 pH7.0 的磷酸缓冲液的配制 .22.1.6 1.0%酪蛋白溶液的配制 .22.1.7 0.4mol/L 的三氯乙酸溶液的配制 .32.1.8 L-酪氨酸标准溶液的配制 .32.2 样品酶液的制备 .32.3 酸性和中性蛋白酶活力的测定方法 .32.4 计算 .4浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）III3 结果与分析 .43.1 标准曲线绘制 .43.2 实验条件对饲料蛋白酶活力的影响 .53.2.1 样品提取液对酸性蛋白酶活力的影响 .53.2.2 底物酪蛋白用量对酸性和中性蛋白酶活力的影响 .63.2.3 不同稀释倍数的样品酶液对酸性和中性蛋白酶活力的影响 .63.2.4 对酸性和中性蛋白酶活力稳定性的测定 .7结论 .7参考文献 .8浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）第 1 页引言蛋白酶是饲料工业中比较常见的一种饲用酶，蛋白酶是可以使蛋白质水解成 -氨基酸的酶，蛋白酶分为酸性酶、碱性酶、中性酶，酸性酶适宜 pH 值为2-5，产生该酶的微生物主要有黑曲霉、根霉、米曲霉；中性蛋白酶的最适宜pH 值为 7 左右，活力值最高时约在 4-50，主要由霉菌和细菌产生，其测定分析方法主要有福林显色法、紫外光谱法。因其紫外分光光度测定法的检出限和定量限都显著低于福林酚法测定法，本文使用福林显色法测定两种酶的活性，其原理是蛋白酶在一定的温度和 pH 条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸） ，在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在 660nm 测定其吸光度，计算出蛋白酶活力。本实验采用福林显色法对饲料蛋白酶活力进行测定，摸索福林酚法测定蛋白酶的条件。并对反应条件进行优化，以提高测定的准确性。1 材料和仪器1.1 原料 含酸性蛋白酶的饲料,含中性蛋白酶的饲料。1.2 仪器设备Lambda-20 型紫外可见分光光度计(美国 Pekin-Elmer 公司)、Sartorious BS 223S 型电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)、HHS-4 型电热恒温水浴锅、精密 pH 计、秒表等。1.3 主要试剂 1mol/L及0.1mol/L的盐酸溶液、0.4mol/L的碳酸钠溶液、福林试剂、pH3.5的乳酸缓冲液、pH7.0的磷酸缓冲液、1.0的酪素溶液（干酪素由杭州微生物浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）第 2 页试剂有限公司生产） 、0.4mol/L的三氯乙酸溶液 、100g/mL L-酪氨酸标准溶液。2 实验方法 2.1 主要试剂的配制 2.1.1 1mol/L 及 0.1mol/L 的盐酸溶液的配制取浓盐酸 85mL,加水稀释并定容至 1000mL，即为 1mol/L 盐酸溶液；取100mL1mol/L 盐酸溶液，定容至 1000mL，即为 0.1mol/L 盐酸溶液。2.1.2 0.4mol/L 的碳酸钠溶液的配制称取无水碳酸钠 42.4g，用水溶解并定容至 1000mL。2.1.3 福林试剂的配制于 1000mL 磨口回流装置中加入钨酸钠（NaWO 4.2H2O）100g、钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)25g、水 700mL、85%磷酸 50mL、浓盐酸 100mL。小火沸腾回流 10h，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂（Li 2SO4）50g，加水 50mL和数滴浓溴水（99%） ，再微沸 15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴） ，冷却后加水定容至 1000mL。混匀过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以 1 份福林试剂与 2 份水混匀，制成稀福林试剂。2.1.4 pH3.5 乳酸缓冲液的配制甲液：称取 80%-90%乳酸 10.6g,加水稀释并定容至 1000mL。乙液：称取 70%乳酸钠 16g，加水稀释并定容至 1000mL。使用溶液：取甲液 2 份，加乙液 1 份，再准确稀释 1 倍。用 pH 计调整 pH至 3.5,备用。浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）第 3 页2.1.5 pH7.0 的磷酸缓冲液的配制甲液：称取磷酸氢二钠（Na 2HPO4.12H2O）71.64g ，用水溶解，并定容至100mL。乙液：称取磷酸二氢钠（NaH 2PO4.2H2O）31.21g，用水溶解，并定容至1000mL。使用溶液：取甲液 610mL，加乙液 390mL 混匀，用 pH 计调整 pH 至（7.00.05） ，备用。2.1.6 1.0%酪蛋白溶液的配制精确称取酪蛋白 1.0000g，先用少量浓乳酸湿润后，再加入乳酸缓冲液使用溶液约 80mL（若测定中性蛋白酶，则先用少量 0.5mol/L 氢氧化钠溶液湿润后，再加磷酸缓冲液使用溶液约 80mL） 。在沸水浴中边加热边搅拌直至完全溶解。冷却后转入 100mL 容量瓶中，用相应缓冲溶液定容至刻度。此容液在 4冰箱贮存，有效期为 3 天。2.1.7 0.4mol/L 的三氯乙酸溶液的配制称取三氯乙酸 65.4g,用水溶解，并定容至 1000mL。2.1.8 L-酪氨酸标准溶液的配制精确称取预先于 105干燥至恒重的 L-酪氨酸标准物质 0.1000g，用 20mL mol/L 盐酸溶解后，再用蒸馏水定容至 100mL，即为 1mg/mL 酪氨酸标准储备溶液。吸取 1mg/mL 酪氨酸标准储备溶液 10.0mL 用 0.1mol/L 盐酸定容至100mL，即得到 100ug/mL L酪氨酸标准溶液。2.2 样品酶液的制备含酸性蛋白酶的添加剂饲料：称取 2g 样品，精致 0.01g，于 100mL 容量瓶中，加入 90mL 蒸馏水或乳酸缓冲液，摇匀后置 40水浴浸提 30min，取出冷却后定容至 100mL，过滤。滤液根据酶活性大小，用乳酸缓冲液使用溶液稀释至适宜浓度。浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）第 4 页含中性蛋白酶的添加剂饲料：称取 2g 样品，精致 0.01g，于 100mL 容量瓶中，加入 90mL 蒸馏水或磷酸缓冲液，摇匀后置 40水浴浸提 30min，取出冷却后定容至 100mL，过滤。滤液根据酶活性大小，用乳酸缓冲液使用溶液稀释至适宜浓度。2.3 酸性和中性蛋白酶活力的测定方法取三支 15150mm 试管（一支空白管，二支样品管） ，分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液 1.0mL，将试管放入（400.2）水浴中预热5min，向二支样品管中再加入一定量的经同样预热的 1%酪素溶液，准确计时，反应 10min，取出。迅速、准确向三支试管中加入 0.4mol/L 三氯乙酸溶液2mL，于空白管中加入与样品管一样量的 1%酪素溶液，摇匀。将三支试管继续置（400.2）水浴中放置 10min，取出迅速冷却至室温。将三支试管中的反应液离心或过滤。另取三支 18180mm 的试管（一支空白管，二支样品管）分别吸取上述相应的滤出液 1.0mL，0.4mol/L 碳酸钠溶液 5.0mL，稀福林试剂1.0mL,摇匀，置（400.2）水浴中放置 20min，取出，迅速冷却至室温。以空白管（对照）调仪器零点，在风光光度计波长 660nm 下，用 10mm 比色杯，分别测二支样品管中样液的吸光度，