河弧菌的阴性表型分子遗传学基础研究 河弧菌 ( Vibrio fluvialis) 是一种新发的食源性致病菌，1975 年首次分离于巴林 1 名腹泻患者粪便中，也曾被称为 F 群弧菌( Group F vibrios) 和 EF 6 弧菌( EF 6 vibrios)。河弧菌自然分布于温暖含盐的水体中，可通过污染海产品、淡水及海水水体得以传播。在人类主要引起急性胃肠炎，临床症状与霍乱很相似，不同的是河弧菌感染的部分患者便中带血;此外也有出血性蜂窝组织炎、脑炎、菌血症及腹膜炎等肠道外感染的报道，曾在孟加拉国、印度等地造成大的暴发流行，美国、日本、中国、约旦、南斯拉夫等国也有河弧菌引起腹泻病例的报道。作为一种嗜盐的革兰阴性兼性厌氧细菌，河弧菌在无盐培养基上一般不能生长或生长不良，在1% 6% 甚至 8% NaCl 培养基上能良好生长。河弧菌的生化表型特征与气单胞菌属相似，API 20E 生化鉴定条的结果常不确定，盐耐受试验有助于区分两者，因为气单胞菌不能在 6% NaCl 培养基上生长。河弧菌与弗尼斯弧菌( V furnissii) 的差别仅在于其发酵葡萄糖而不产气。精氨酸双水解酶、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶及阿拉伯糖发酵实验常被用作区分河弧菌和霍乱弧菌及其他不凝集弧菌的种特异性鉴定所需的 4 个基础生化指标。河弧菌表现为精氨酸双水解酶阳性、阿拉伯糖发酵阳性、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶阴性。精氨酸双水解酶系统通过 3 个酶促反应将精氨酸经瓜氨酸转变为鸟氨酸、CO2和 NH3。首先在精氨酸脱亚氨酶( arginine deiminase，arcA 编码)的作用下，精氨酸 + H2O 生成瓜氨酸和 NH3; 在鸟氨 酸 氨 基 甲 酰 转 移 酶 ( ornithinecarbamoyltransferase) 的催化下瓜氨酸 + Pi 生成鸟氨酸 和 磷 酸 氨 甲 酰，最 后 在 氨 基 甲 酸 激 酶( carbamate kinase) 的作用下磷酸氨甲酰 + ADP 生成 ATP、CO2和 NH3。该系统的编码基因为 arc 操纵子，包括 arcA、arcB、arcC 三个基因分别编码精氨酸脱亚氨酶、鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酸激酶，在不同种的细菌中其组织结构和排列方式有所不同，如在猪链球菌( Streptococcus suis) 中为arcABC 结构，而在弗尼斯弧菌中为 arcBCA 结构。我们在前期工作中发现 1 株精氨酸双水解酶阴性的河弧菌 Ma 2531，本研究进一步探索了决定该阴性表型的分子遗传学基础。1 材料方法1. 1 菌株来源及鉴定菌株 Ma 2531 分离自马鞍山1 例腹泻患者粪便标本，EF85003 分离自新疆1例腹泻患者粪便标本。API 20E 生化鉴定条和针对河弧菌 toxR 基因保守序列及 16S 23S rDNA 间隔序 列 的 2 对 特 异 性 引 物 toxR-F/toxR-R和VFLU-F / VFLU-R鉴 定 为 河 弧 菌，标 准 菌 株CICC21612 购 自 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院( NIFDC) ，作为阳性对照。1. 2 试剂和仪器聚合酶链反应( PCR) 扩增特异性引物由上海生工生物技术有限公司合成，PCR 扩增的酶及相应试剂，DL5000 Marker 购自大连宝生物工程有限公司; API 20E 生化鉴定条为法国bioMrieuxsa 公司产品，精氨酸双水解酶生化鉴定管( 073130 和 0713140) 购自广东环凯。PCR 扩增仪为 MJ 公司的 PTC200，凝胶成像仪为 Bio-Rad GelDoc XR 系 统。 酶 联 检 测 仪 为 奥 地 利 Tecan 的Infinite M200 Pro。pH 计为德国 Mettler Toledo 的FiveEasy。1. 3 PCR 检测1. 3. 1 引 物 种 特 异 性 鉴 定 引 物 参 照 文 献进行，精氨酸双水解酶代谢基因簇检测引物根据弗尼斯弧菌 NCTC 11218 的基因组序列和河弧菌相关序列 KC569550通过软件 Oligo 6. 0设计，序列见表 1。【表1】针对 arcBCA 编码基因的引物对 arc-F/arc-R、arc-F / arc-rev 和 arc-ck-up / arc-R 对 Ma 2531 的扩增结果均为阴性，对照菌株均给出预期大小的特异性扩增条带，说明 arcBCA 基因簇在 Ma 2531 中的缺失。笔者针对 arc 操纵子两侧的序列设计了引物arc1-up / arc1-dn 和 arc72695-up / arc75219-dn 进行扩增，结果 Ma 2531 扩增出和对照菌株一致的条带，说明 存 在 相 关 序 列，然 后 分 别 以 arc1-dn 和arc72695-up 的反向互补序列作为上下游引物 arc1-dnRev 及 arc72695-upRev 对 Ma 2531 进行扩增，获得 1500 bp 的扩增条带，测序分析表明，该扩增片段包含 transposase IS4 的序列和 argR 5部分序列及arcD 基因后间隔区的部分序列。该结果证实在菌株 Ma 2531 中由于 transposase IS4 的插入导致了包括精氨酸双水解酶系统 arcBCA 基因簇及上游的天冬氨酸氨甲酰转移酶调节亚基和催化亚基编码基因在内的约 8. 6 kb 大片段的缺失，从而导致Ma 2531精氨酸双水解酶阴性的生化表型。2. 3 生长曲线和 pH 值的测定 文献报道链球菌和嗜水气单胞菌的精氨酸双水解酶系统有助于细菌细胞对酸性环境的抗性，通过水解精氨酸产生NH3，逆转酸性的不良生长环境。为此，笔者比较了精氨酸双水解酶系统阴性和阳性菌株 Ma 2531 及 EF85003 在液体 LB 中 pH 值和生长曲线变化( 图 4 5) ，从图中可看出无论是生长曲线，还是正常( pH 7. 0) 及酸性( pH 5. 4) 培养条件下的 pH 值变化，二者均呈现相同的趋势，说明精氨酸双水解酶系统的缺失不影响 Ma 2531 的生长和对酸性环境的抵抗，提示在河弧菌中可能存在其他的代偿机制能抵御培养液的酸化，但也不能排除 2 株菌株遗传背景差异所带来的影响。【图4-5】3 讨论精氨酸双水解酶又称精氨酸脱亚氨酶( argininedihydrolase) 、瓜氨酸亚氨酶 ( citrulline iminase) 、或精氨酸脱亚氨酶( L-arginine deiminase) ，是弧菌科细菌鉴别的重要生化指标之一。河弧菌精氨酸双水解酶一般为阳性，而精氨酸双水解酶阴性河弧菌的出现增加了通过生化表型实验来鉴定河弧菌的难度和不确定性，由 transposase IS4 插入导致的精氨酸双水解酶阴性的河弧菌为首次报道。鉴于转座子的可移动性，不排除其在自然界或感染宿主体内环境中在不同菌株间转移，从而造成新的表型特征菌株的出现。细菌通过精氨酸双水解酶系统水解精氨酸作为能量来源，在猪链球菌中该系统还被认为是一潜在的毒力因子，有助于菌株对酸性环境中的抵抗，提升生物适应性。本研究中也比较了精氨酸双水解酶系统正常和缺失的 2 株菌的生长曲线和培养液 pH 值变化，没有发现差别，除菌株遗传背景差异的影响外，实验中选择 LB 这种富营养的培养液可能也起了屏蔽作用，在后续研究中笔者拟使用低营养成分培养基( minimal medium) 和人工构建精氨酸双水解酶系统缺失的菌株，在相同遗传背景下进一步研究精氨酸双水解酶系统在河弧菌的致病和环境生存中的生理意义。-全文完-