如何从动物肝脏中提取一种酶,1,设计实验报告,1103018 宋 跃 1103019 胡嘉健 1103020 刘炫邑 1103021 石雨晴,Experimental design report,如何从动物肝脏中提取一种酶,2,一，如何正确设计从生物样品中分离纯化生物大分子的路线和正确的设计方案？ 二，案例实验：从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶,如何从动物肝脏中提取一种酶,3,如何正确设计从生物样品中分离纯化生物大分子的路线和正确的设计方案？,如何从动物肝脏中提取一种酶,4,1，确定生物大分子的种类 2，查阅文献资料确定生物大分子的性质例如，分子量，等电点，沉降细数溶解度，耐热性等 3，查阅分离纯化鉴定的方法以及其各有何特点和适用范围 4，根据所测生物大分子的已知条件和实际情况选择合适的分离纯化方法 5，根据选取的方法设计实验具体步骤,如何从动物肝脏中提取一种酶,5,1，正确选材 总的来说，材料选择应遵循的原则是：有效成分含量多，稳定性好；来源丰富、保持新鲜；提取容易、工艺简单；杂质有综合利用价值。 2，材料预处理 及时使用避免有效成分丧失，否则应及时冰冻或干燥储存，同时把易于除去的非需要物质（如脂质）除去。 3，初分 根据目标大分子的性质确定初分方法，保证回收率高。,如何从动物肝脏中提取一种酶,6,4，纯化 按照先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理的方法，后选择精确、费时和需样品量少的方法的原则确定分离方法的排布顺序。 5，鉴定 用于鉴定性质和含量的方法有：光谱法、气象层析法和生物芯片法等。用于鉴定生物样品纯度的方法有：电泳法、免疫分析。 根据实验目的确定鉴定方法，操作务必准确，尽量避免目标物质的流失,如何从动物肝脏中提取一种酶,7,案例实验： 从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶,如何从动物肝脏中提取一种酶,8,实验目的： 1，掌握从肝细胞中分离提取纯化鉴定某种酶的实验方法 2，培养灵活选择并综合使用各种生物实验方法的能力 3， 培养探索精神及团队合作意识,如何从动物肝脏中提取一种酶,9,一，材料预处理 1，因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。 2，由于细胞膜的半透膜性质，将细胞置于低渗溶液中，细胞易胀破，通过搅碎研磨可以得到细胞质中的胞液以及细胞核等各种细胞器和少量的细胞器碎片。 3，由于目前未知该酶的具体位置，因此对胞液，细胞核和线粒体应该分开研究，使得提取物中杂质尽量减少。,实验原理,如何从动物肝脏中提取一种酶,10,二，盐溶液提取法(Salt solution extraction method ) （将线粒体和细胞核中的酶分别用盐溶液提取） 根据蛋白质和酶的结构及溶解性质的不同选择适当的溶剂进行提取。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质的溶解度大，稳定性好，在蛋白质和酶的提取过程中经常采用。故本实验采用0.02mol/L磷酸盐缓冲液。,实验原理,如何从动物肝脏中提取一种酶,11,三， 盐析原理(Salting out ) 蛋白质在水中以胶体形式存在是由于表面附有水化膜和表面电荷，在盐析过程中，盐溶液中的离子破坏了这两个因素使得蛋白质能够凝聚在一起沉淀下来达到分离的目的。利用离心的方法将沉淀和上清液分离。,实验原理,如何从动物肝脏中提取一种酶,12,四，等电点沉淀(Isoelectric point precipitation ) 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的pH值或盐浓度，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。,实验原理,如何从动物肝脏中提取一种酶,13,五，离子交换柱层析(Ion exchange column chromatography )， 按照可交换离子的类型分为阳离子交换柱色谱法和阴离子交换柱色谱法。根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和解吸而将电解质各组分分开。 在离子交换过程中，可以将杂蛋白选择性地结合到离子交换剂上，其余蛋白存在于过柱液中;或将欲分离蛋白选择性地结合到离子交换剂上，杂蛋白存在于过柱液中;或几种带同性电荷的蛋白均结合到交换剂上，利用其结合的牢固程度不同(即带电荷的数目不同)，静电引力不同，分步洗脱下来，达到分离的目的。,实验原理,如何从动物肝脏中提取一种酶,14,六，脱盐 经过各种纯化手段提取的蛋白质溶液经常含有较高的盐离子浓度，需要将多余的盐离子去除，称为蛋白质的脱盐，脱盐的主要方法有透析法，超滤法，凝胶过滤法等。,实验原理,如何从动物肝脏中提取一种酶,15,七，SDS电泳(SDS electrophoresis ) 该方法中，由于该蛋白质有三个大小不同的亚基，所以将会形成三条不同的区带。达到了实验鉴定的目的。,SDS-PAGE：使用阴离子去污剂十二烷基硫酸钠，先将蛋白质大分子变性，并与其蛋白质分子结合形成带负电荷蛋白质-SDS复合体沿着以聚丙烯酰胺凝胶形成的分子筛向电场的正极方向移动，从而将蛋白质根据它们分子量的大小而分开。由于小分子量的蛋白质移动速度大于分子量较大的，所以在垂直凝胶中其蛋白质分子量由上至下递减。,实验原理,如何从动物肝脏中提取一种酶,16,实验步骤,实验取材 因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。,细胞破碎 加入蛋白质抑制剂，防止蛋白酶水解作用（常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸） ） 除核酸： 一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%2%的链霉素硫酸盐、溶菌酶等。,破碎方法：机械研磨 将剪碎的兔肝置于研钵中用研磨棒研碎，（加入一定的石英可提高研磨效果）也可用匀浆器进行匀浆，加入低渗溶液。运用差速离心法在1600r/min 离心机中离心得到上清一和沉淀一。将沉淀加入一定浓度蔗糖溶液后在3500r/min离心机离心得到上清二和沉淀二（细胞核）。将上清一二混合，取少量上清液在6600r/min离心机中离心得到沉淀三是线粒体，弃去上清液（微粒体与溶酶体） 最后得到上清液为胞液，沉淀二为细胞核，沉淀三为线粒体 以下步骤分别对三部分进行操作,如何从动物肝脏中提取一种酶,17,酶的分离提取 盐溶液提取（适用于大多数酶。 ） 用0.02mol/L磷酸盐缓冲液提取线粒体和细胞核中的酶,一，初分，盐析 使用饱和硫酸铵以一定的恰当比例，使蛋白质析出，视具体情况通过过滤和离心的方法沉淀分离出来，得到的沉淀即为蛋白质 等电点沉淀法 将上一步得到的沉淀溶解在ph为6.2的缓冲液中，离心后得到上清液和沉淀， 弃去上清，沉淀即为所有pI为6.2的蛋白质 二，精分，离子交换柱层析法 利用DEAE纤维素（为）作为阴离子交换剂，带有正电荷可以吸附带有负电荷的蛋白质 DEAE预处理，装柱，平衡样品上样与洗脱收集得到相对纯净的蛋白质 利用CM-纤维素（ph为5.0）作为阳离子交换剂，吸附带正电荷的酶 DEAE的再生与保存,实验步骤,如何使线粒体和细胞核破碎？,如何从动物肝脏中提取一种酶,18,脱盐，使用透析袋脱盐 SDS电泳，1，制备待测蛋白质样品：2，垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制：3，加样：4，电泳：5，剥胶：6，染色和褪色。,实验步骤,如何从动物肝脏中提取一种酶,19,实验结果： 观察脱色后凝胶中的蛋白质区带，若被测蛋白质样品分离纯化的好，纯度高，应出现三条区带，若在同一凝胶板不同泳道上加一个标准该酶样品同时进行电泳，所观察到的蛋白区带的迁移率应和标准品的电泳迁移率一样。,如何从动物肝脏中提取一种酶,20,注意事项 由于该酶未知，因此，在具体操作本实验过程时，应该在实验中经过多次实验确定具体的实验试剂选择和实验途径。,如何从动物肝脏中提取一种酶,21,Any question ?,如何从动物肝脏中提取一种酶,22,谢,Thanks, ,.,Merci,Danke,Gracias,Grazie,